SINTESIS CONTROLADA DE POLIGLUTAMATOS CON BAJA POLIDISPERSIDAD Y ARQUITECTURAS VERSÁTILES.

Síntesis controlada de poliglutamatos con baja polidispersidad y arquitecturas versátiles,

se refiere al control de la polimerización de N-carboxianhídridos de α-aminoácidos (NCAs) a través del uso de sales no nucleofílicas con la finalidad de obtener arquitecturas poliméricas altamente versátiles, con bajos índices de polidispersidad, (homopolímeros, polímeros dibloque, tribloque o sistemas multibloque), así como a procesos para la preparación de los mismos y su utilización en composiciones farmacéuticas, entre otros, agentes de imagen molecular. Concretamente se refiere a la obtención de poliglutamatos funcionales con estructura definida, peso molecular ajustable y baja polidispersidad (D = Mw / Mn< 1.3) mediante la polimerización de apertura de anillo de N-carboxianhídridos. Asimismo, los grupos ácido de la cadena polimérica de los poliglutamatos se pueden activar con 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolina permitiendo la introducción de diversas funcionalidades por "modificación post-polimerización" formándose diferentes grupos reactivos en las cadenas laterales del polímero. Los restos reactivos, tales como azidas, maleimidas, tioles, alquinos (lineales o cíclicos) ofrecen la oportunidad de conjugación específica, útiles para fármacos, unidades dirigentes o marcadores.

Sintesis controlada de poliglutamatos con baja polidispersidad y arquitecturas versátiles SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al control de la polimerización de N-carboxianhídridos de a-aminoácidos (NCAs) a través del uso de sales no nucleofílicas con la finalidad de obtener arquitecturas poliméricas altamente versátiles, con bajos índices de polidispersidad, (homopolimeros, polímeros dibloque, tribloque o sistemas multibloque) , así como a procesos para la preparación de los mismos y su utilización en composiciones farmacéuticas y/o como agente para el diagnóstico de imagen.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Un polímero ideal para ser usado como portador en el transporte de fármacos o agente para el diagnóstico de imagen debe caracterizarse por poseer (i) biodegradabilidad o un peso molecular adecuado que evite su acumulación progresiva in vivo , (ii) baja polidispersidad, de manera que asegure una homogeneidad aceptable del sistema final permitiendo ajustar las propiedades farmacocinéticas del mismo; (iii) tiempoelevado de residencia en el cuerpo, para prolongar la acción del conjugado o permitir su distribución y acumulación en los compartimentos deseados del cuerpo (por lo tanto, se prefieren pesos moleculares elevados) y (iv) en el caso de conjugación de proteínas, un único grupo reactivo para evitar reacciones de entrecruzamiento (quot;crosslinking') , mientras que para el caso de conjugación de fármacos pequeños, es preferible que el portador contenga varios grupos reactivos que permitan modular y optimizar la carga del fármaco (multivalencia) .

Debido a su naturaleza implícita, los polímeros presentan diversos retos a la hora de su desarrollo farmacológico. Un fármaco manufacturado debe ser homogéneo y estar compuesto por una única especie definida. Por el contrario, todos los polímeros sintéticos son inherentemente heterogéneos y, como macromoléculas pueden presentar diversos desafíos en su caracterización. El control exhaustivo de parámetros cruciales como el peso molecular, la polidispersidad, la localización de las cargas o el balance hidrofobia-hidrofilia es un requisito para modular la biodistribución, el destino final, la actividad biológica y la toxicidad.1, 2 El peso molecular medio se expresa en terminos de “peso molecular promedio, en peso” (Mw) y “peso molecular promedio en número” (Mn) , y el cociente Mw/Mn proporciona una medida de la dispersidad D.

Por lo tanto, existe un creciente interés y una necesidad en el desarrollo de metodologías para la obtención desistemas poliméricos biodegradables con mayores pesos moleculares, controlando la homogeneidad de los mismos en el proceso, y permitiendo un alto grado de versatilidad para ser posteriormente implementados en diversas necesidades clínicas.

La polimerización por apertura de anillo (ROP del acrónimo inglés “ring-opening p olymerisation') de Ncarboxianhídridos de aminoácidos (NCAs) es la técnica de polimerización más amplia y comúnmente aplicada para obtener polipéptidos y copolímeros de bloque basados en polipéptidos en escala multigramo. A pesar de que los polímeros obtenidos son menos definidos que los péptidos producidos por un organismo natural, este método de polimerización permite el acceso a arquitecturas poliméricas que están por encima de las posibilidades de la naturaleza. Además, la apertura de anillo de NCAs ya ha sido empleada en varias aplicaciones dentro de diferentes campos de la ciencia. Dichas aplicaciones van desde el desarrollo de sistemas de transporte de fármacos o agentes moleculares de imagen a materiales para recubrimiento de superficies2-6

Como ejemplo prominente del uso de polimerización de NCAs debe mencionarse el conjugado de ácido poliglutámico (PGA) y paclitaxel (Opaxio®, formalmente Xyotax, PPX, CT-2103) . El conjugado polímero-fármaco se encuentra en fase clínicaIII, 7-9lo que pone de manifiesto la importancia del método de polimerización de NCAs para la preparación de polipéptidos sintéticos definidos. El ácido poliglutámico es un material prometedor para el diseño de nanomedicinas debido a su elevada biocompatibilidad, multivalencia y a su degradabilidad in vivo mediada por tiol proteasas (Catepsina B) .10-11

Desde el punto de vista histórico, la polimerización de NCAs es un método relativamente antiguo ya que fue descubierto por Leuch al inicio del siglo XX.12-14 Desde entonces, se han estudiado y publicado diferentes metodologías de polimerización.15-17Hasta el momento las aproximaciones químicas más prometedoras se basan en la iniciación de NCAs purificados con aminas primarias combinado con el uso de técnicas de alto vacío, 18-20 el uso de sales hidroclóricas de amonio como iniciadores, 21catalizadores basados en metales pesados22-24 o hexametildisilazanos (HMDS) .25-26

Sin embargo, la mayoría de estos métodos poseen limitaciones para la síntesis de polipéptidos bien definidos. Por ejemplo, las aminas hexametildisilazanos (HMDS) son sensibles a reacciones de hidrólisis, y los catalizadores basados en metales pesados deben eliminarse posteriormente a la polimerización siempre que se pretenda una aplicación biomédica. Además, la eliminación de dichos metales es tediosa por lo que generalmente es incompleta.

La iniciación normal basada en el uso de aminas primarias proporciona en la mayoría de los casos un control reducido debido al propio proceso de polimerización. Existen reacciones secundarias que interfieren en el proceso de polimerización, especialmente cuando se requieren elevados grados de polimerización o arquitecturas complejas. En general, los poliglutamatos con un peso molecular en el rango entre algunos miles y 50.000 g/mol e índices de polidispersidad (IPDs) de 1.2 a 1.5 se encuentran descritos en literatura17 IPDs superiores se atribuyen con toda probabilidad al hecho de que la polimerización de NCAs sufre de la presencia de reacciones secundarias. La más importante de ellas es la que se conoce como proceso del “monómero activado” (quot;Activated Monomer”) que tiene lugar por la desprotonación de una molécula de monómero NCA. El anión generado en el NCA es lo suficientemente nucleofílico como para iniciar la oligomerización de NCAs. Los N-aminoacil NCA derivados formados en el proceso pueden tanto añadirse a la cadena en propagación como llevar a cabo procesos de autocondensación, estos últimos produciendo elevados pesos moleculares a elevados a elevadas conversiones de monómero. Debido a que las aminas primarias pueden actuar como nucleófilos y como bases, el proceso de polimerización oscilará siempre entre ambos mecanismos, “amina normal” y “monómero activado”.

Una estrategia para obtener polipéptidos más definidos es la disminución de la temperatura de reacción, debido a que ello implica la disminución/supresión de diversas reacciones secundarias, sin embargo, ello implica un aumento de los tiempos de reacción de entre 2 a 4 veces, conllevando también una disminución en el rendimiento.27-29Sin embargo, para la producción de polímeros de bloque (di-, tri- o multibloque) , la polimerización de NCAs debe proceder preferentemente con altas conversiones via mecanismo de amina normal; es decir, iniciación nucleofílica de la polimerización de manera que los polímeros resultantes estén provistos de grupos terminales bien definidos. El control

sobre los grupos terminales poliméricos es esencial en la metodología de síntesis de arquitecturas multibloque.30

Knobler y colaboradores31, 32 evitan el mecanismo del “monómero activado” con la simple adición de un ácido, de manera que se induzca la reprotonación de los eventualmente formados NCAs. Estos autores investigaron la reacción estequiométrica entre NCAs y las sales hidroclóricas de aminas primarias para la preparación de derivados aminoacilos. Schlaad y colaboradores usaron este método para preparar copolímeros híbridos de naturaleza definida basados en poliestireno.21

La principal desventaja de esta aproximación es el hecho de que el ion cloruro como tal puede actuar como nucleófilo o como base, desprotonando el monómero NCA y por lo tanto, dando lugar a reacciones secundarias.

Para comprobar el alcance de varias de las metodologías descritas en la literatura hasta el momento, como el uso de aminas primarias como iniciadores y el método desarrollado por Schlaad, se llevaron a cabo varios experimentos 30 en nuestro laboratorio, cuyos resultados se muestran a continuación.

Tabla1. Comparación entre la aproximación basada en el uso de aminas primarias como método de polimerización de NCAs y la técnica de polimerización de Schlaad

1. Método de obtención de poliglutamatos por medio de la polimerización controlada de N-carboxianhidridos de aaminoácidos (NCAs) caracterizado por utilizarun anión no nucleofílico como iniciador: el tetrafluoroborano, de acuerdo con la siguiente fórmula:

donde:

R representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acetales, ácidos carboxílicos activados) , etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde 100 a 20000g/mol) .

n representa el número de unidades de y-benzylglutamato en el polímero, de 1 a 1000

2. Método de obtención de poliglutamatos por medio de la polimerización controlada de N-carboxianhidridos de aaminoácidos (NCAs) , de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el tetrafluoroborano es el tetrafluoroborano de amonio.

3. Método de obtención de poliglutamatos por medio de la polimerización controlada de N-carboxianhidridos de aaminoácidos (NCAs) , de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, en el que R es la n-butilamina.

4. Método de obtención de poliglutamatos por medio de la polimerización controlada de N-carboxianhidridos de aaminoácidos (NCAs) , de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, en el que R es polietilenglicol.

5. Método de obtención de poliglutamatos por medio de la polimerización controlada de N-carboxianhidridos de aaminoácidos (NCAs) , de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, obteniéndose el producto con forma de di-bloque cuya síntesis se muestra en la fórmula siguiente:

Donde R1 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acetales, ácidos carboxílicos activados) , etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde 100 a 20000g/mol) y R3 representa un grupo alquilo, punto de unión Cterminal definido (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acetales, ácidos carboxílicos activados) ; etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde n=2 a n=16) ; aminoácidos tales

comolisina, arginina, imidazol e histidina, y grupos amino secundarios y terciarios, y

x representa el número de unidades de monómero incluido en definición R1, de 1 a 500

y representa el número de unidades de glutámico modificadas con el grupo R3 en el polímero, de 1 a 1000

z representa el número de unidades de glutámico sin modificar en el polímero, de 1 a 1000

5

6. Método de obtención de poliglutamatos por medio de la polimerización controlada de N-carboxianhidridos de a

aminoácidos (NCAs) , de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, obteniéndose el producto con forma de tri

bloque cuya estructura se muestra en la siguiente fórmula:

Donde

R1 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acetales, ácidos carboxílicos activados) , etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG,

desde 100 a 20000g/mol) .

R2 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acetales, ácidos carboxílicos activados) , etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde 100 a 20000g/mol) , PEG-tiol, PEG-4TP.

R3 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido ( (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acetales, ácidos carboxílicos activados) , etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde n=2 a n=16) ; aminoácidos tales como lisina, arginina, imidazol e histidina, cisteína y grupos amino secundarios y terciarios.

x representa unidades de monómeros incluidos en definición R1 de 1 a 500

y representa el número de unidades de glutámico modificadas con el grupo R3 en el polímero, de 1 a 500

z representa el número de unidades de glutámico sin modificar en el polímero, de 1 a 1000

p representa unidades de monómero incluidos en definición R3, de 1 a 500

7. Método de obtención de poliglutamatos por medio de la polimerización controlada de N-carboxianhidridos de aaminoácidos (NCAs) , de acuerdo con las reivindicaciones 1-6, mediante la reacción entre los dibloques PEG-PGA previamente obtenidos y un derivado de PEG funcionalizado con un grupo carboxilo activado, obteniéndose los sistemas tri-bloque según se muestra en la formula siguiente:

Donde:

R1 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acetales, ácidos carboxílicos activados) , etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde 100 a 20000g/mol) .

R2 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acetales, ácidos carboxílicos activados) , etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde 100 a 20000g/mol) , PEG-tiol, PEG-4TP.

R3 representa un grupo alquilo, punto de unión C-terminal definido ( (alquino, azida, tioles, haluros, tioles activados, alquenos, ésteres activados, alcoholes activados, aminos protegidos, grupos maleimido, acetales, ácidos carboxílicos activados) , etilenglicol (EG) de diferentes pesos moleculares incluyendo polietilenglicol (PEG, desde n=2 a n=16) ; aminoácidos tales como lisina, arginina, imidazol e histidina, cisteína y grupos amino secundarios y terciarios.

representa unidades de monómeros incluidos en definición R1 de 1 a 500

y representa el número de unidades de glutámico modificadas con el grupo R3 en el polímero, de 1 a 500

z representa el número de unidades de glutámico sin modificar en el polímero, de 1 a 1000

p representa unidades de monómero incluidos en definición R3, de 1 a 500

R2 y R3 pueden ser utilizados para la conjugación de agentes bioactivos (incluyendo fármacos de bajo peso molecular, péptidos, proteínas, anticuerpos) , sondas fluorescentes del infrarrojo cercano, complejos de coordinación para MRI, PET y sondas SPECT.

8. Método de obtención de poliglutamatos por medio de la polimerización controlada de N-carboxianhidridos de aaminoácidos (NCAs) , de acuerdo con las reivindicaciones 1-7, en el que una vez obtenido el polímero de poliglutamato, este se modifica introduciendo cadenas de polietilenglicol en la cadena polimérica, con objeto de obtener moléculas que sean capaces de modificar el comportamiento in vivo, la biodistribución y la aplicación terapéutica del correspondiente agente bioactivo.

9. Poliglutamatos obtenidos por el método de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Utilización de los poliglutamatos de la reivindicación 9 como transportadores y administradores de fármacos.

11. Utilización de los poliglutamatos de la reivindicación 9 como agentes de diagnóstico por imagen molecular.

FIGURA 1

FIGURA 3

FIGURA 4

FIGURA 5

FIGURA 6

FIGURA 7

FIGURA 8 FIGURA 9

min. 30 min. 1 hour 2 hours 5 hours FIGURA 11

Suero

HClO4

MeOH ACN

100000 80000 60000 40000 20000

k-

FIGURA 12A

4h 24h

TB-OG200_4TP

fluorescencia (AU)

FIGURA 12B

600000 500000 400000 300000 200000 100000 0

Fluorescencia (AU) / g tejido TB TBO 4h TBO 24h

FIGURA 13

(A)

(B)

FIGURA 14

A B