Serotipo rh10 de virus adeno-asociado (AAV).

Un virus adeno-asociado (AAV) que comprende una cápside de AAV que comprende una vp1 de AAVrh10,

quecomprende aminoácidos 1 a 738 de SEQ ID Núm. 81 o una secuencia que es al menos un 95% idéntica a la misma,un minigén que tiene repeticiones terminales invertidas (ITRs) de AAV, y un gen heterólogo enlazadooperativamente a secuencias reguladoras que dirigen su expresión en una célula anfitrión.

Serotipo rh10 de virus adeno-asociado (AAV) .

Antecedentes de la invención Un virus adeno-asociado (AAV) , un miembro de la familia Parvovirus, es un virus icosaédrico pequeño, sin envoltura, con genomas de ADN de cadena lineal simple de 4, 7 kilobases (kb) a 6 kb. El AAV se asigna al género Dependovirus debido a que el virus fue descubierto como uno de los contaminantes en poblaciones de adenovirus purificados. El ciclo de vida del AAV incluye una fase latente en la que los genomas de AAV, tras la infección, están integrados específicamente en el sitio en cromosomas anfitrión, y una fase infecciosa en la que, a continuación de la infección por adenovirus o bien por virus herpes simplex, los genomas integrados son posteriormente rescatados, replicados y empaquetados en virus infecciosos. Las propiedades de la amplia gama de anfitriones, de no patogenicidad, incluyendo células no divisoras, y la potencial integración cromosómica específica del sitio, hacen de un AAV una herramienta atractiva para transferencia de gen.

Los recientes estudios han sugerido que los vectores de AAV pueden ser el vehículo preferido para terapia de gen. Hasta la fecha, han existido 6 serotipos diferentes de AAVs aislados en humanos o en primates no humanos (NHP) , y bien caracterizados. Entre ellos, el serotipo 2 humano es el primer AAV que fue desarrollado como vector de transferencia de gen; éste ha sido utilizado ampliamente para experimentos eficaces de transferencia de gen en diferentes tejidos objetivo y modelos animales. Los ensayos clínicos de la aplicación experimental de vectores basados en AAV2 en algunos modelos de enfermedades humanas, están en progresión, e incluyen enfermedades tales como fibrosis quística y hemofilia B.

Resultan deseables construcciones a base de AAV para suministro genético.

Rutledge, E., et al, J. Virol. (1998) , 72 (1) : 309-319, enseña los serotipos 2, 3, 4 y 6 de AAV.

Sumario de la invención La invención proporciona nuevos AAV rhesus para secuencias, vectores que contienen a las mismas, y métodos para usarlas, según se define en las reivindicaciones anexas.

Estos y otros aspectos de la invención se pondrán fácilmente de relieve a partir de la descripción detallada que sigue de la invención.

Breve descripción de los dibujos Las Figuras 1A a 1AAAR proporcionan un alineamiento de secuencias de ácido nucleico que codifican al menos las proteínas caps para los serotipos de AAV. Se proporcionan las secuencias de longitud completa que incluyen las ITRs, la región rep y la región de cápside para el serotipo 7 de AAV [SEQ ID Núm. 1], y para el AAV1 anteriormente publicado [SEQ IN Núm. 6], AAV2 [SEQ ID Núm. 7] y AAV3 [SEQ ID Núm. 8]. Los nuevos serotipos de AAV, el AAV8 [SEQ ID Núm. 4] y AAV9 [SEQ ID Núm. 5], están sujetos a solicitudes de patentes co-presentadas. Los otros clones novedosos proporcionados en este alineamiento incluyen: 42-2 [SEQ ID Núm. 9], 42-8 [SEQ ID Núm. 27], 4215 [SEQ ID Núm. 28], 42-5b [SEQ ID Núm. 29], 42-1b [SEQ ID Núm. 30], 42-13 [SEQ ID Núm. 31], 42-3a [SEQ ID Núm. 32], 42-4 [SEQ ID Núm. 33], 42-5a [SEQ ID Núm. 34], 42-10 [SEQ ID Núm. 36], 42-11 [SEQ ID Núm. 37], 426b [SEQ ID Núm. 38], 43-1 [SEQ ID Núm. 39], 43-5 [SEQ ID Núm. 40], 43-12 [SEQ ID Núm. 41], 43-20 [SEQ ID Núm. 42], 43-21 [SEQ ID Núm. 43], 43-23 [SEQ ID Núm. 44], 43-25 [SEQ ID Núm. 45], 44.1 [SEQ ID Núm. 47], 44.5 [SEQ ID Núm. 47], 223.10 [SEQ ID Núm. 48], 223.2 [SEQ ID Núm. 49], 223.4 [SEQ ID Núm. 50], 223.5 [SEQ ID Núm. 51], 223.6 [SEQ ID Núm. 52], 223.7 [SEQ ID Núm. 53], A3.4 [SEQ ID Núm. 54], A3.5 [SEQ ID Núm. 55], A3.7 [SEQ ID Núm. 56], A3-3 [SEQ ID Núm. 57], 42.12 [SEQ ID Núm. 58], 44.2 [SEQ ID Núm. 59]. Las secuencias de nucleótido de las regiones de signatura de AAV10 [SEQ ID Núm. 117], AAV11 [SEQ ID Núm. 118] y AAV12 [SEQ ID Núm. 119], se proporcionan en esta Figura. Se muestran puntos de referencia críticos en las estructuras de genomas de AAV. Las separaciones se han mostrado mediante puntos. La ITR 3’ de AAV 1 [SEQ ID Núm. 6] ha sido mostrada con la misma configuración que en las secuencias publicadas. TRS representa el sitio de resolución terminal. Obsérvese que el AAV7 es el único AAV informado que utiliza GTG como codón de iniciación para VP3.

Las Figuras 2A a 2F son un alineamiento de las secuencias de aminoácido de las proteínas de cápside de vp1 de serotipos de AAV anteriormente publicados [SEQ ID Núm. 64], AAV2 [SEQ ID Núm. 70], AAV3 [SEQ ID Núm. 71], AAV4 [SEQ ID Núm. 63], AAV5 [SEQ ID Núm. 114], y AAV6 [SEQ ID Núm. 65] y nuevas secuencias de AAV de la invención, incluyendo: C1 [SEQ ID Núm. 60], C2 [SEQ ID Núm. 61], C5 [SEQ ID Núm. 62], A3-3 [SEQ ID Núm. 66], A3-7 [SEQ ID Núm. 67], A3-4 [SEQ ID Núm. 68], A3-5 [SEQ ID Núm. 69], 3.3b [SEQ ID Núm. 62], 223.4 [SEQ ID Núm. 73], 223-5 [SEQ ID Núm. 74], 223-10 [SEQ ID Núm. 75], 223-2 [SEQ ID Núm. 76], sse-7 [SEQ ID Núm. 77], 223-6 [SEQ ID Núm. 78], 44-1 [SEQ ID Núm. 79], 44-5 [SEQ ID Núm. 80], 44-2 [SEQ ID Núm. 81], 42-15 [SEQ ID Núm. 84], 42-8 [SEQ ID Núm. 85], 42-13 [SEQ ID Núm. 86], 42-3A [SEQ ID Núm. 87], 42-4 [SEQ ID Núm. 88], 42-5A [SEQ ID Núm. 89], 42-18 [SEQ ID Núm. 90], 42-5B [SEQ ID Núm. 91], 43-1 [SEQ ID Núm. 92], 43-12 [SEQ ID Núm.

93], 43-5 [SEQ ID Núm. 94], 43-21 [SEQ ID Núm. 94], 43-21 [SEQ ID Núm. 96], 43-25 [SEQ ID Núm. 97], 43-20 [SEQ ID Núm. 99], 24.1 [SEQ ID Núm. 101], 42.2 [SEQ ID Núm. 102], 7.2 [SEQ ID Núm. 103], 27.3 [SEQ ID Núm. 104], 16.3 [SEQ ID Núm. 105], 42.10 [SEQ ID Núm. 106], 42-3B [SEQ ID Núm. 107], 42-11 [SEQ ID Núm. 108], F1 [SEQ ID Núm. 109], F5 [SEQ ID Núm. 110], F3 [SEQ ID Núm. 111], 42-6B [SEQ ID Núm. 112], 42-12 [SEQ ID Núm. 113]. Nuevos serotipos AAV8 [SEQ ID Núm. 95] y AAV9 [SEQ ID Núm. 100], son el objeto de solicitudes de patente co-presentadas.

Las Figuras 3A a 3C proporcionan las secuencias de aminoácido de las proteínas rep de AAV7 [SEQ ID Núm. 3].

Descripción detallada de la invención La invención se refiere a secuencias de ácido nucleico identificadas según los métodos descritos en la presente memoria. Uno de tales virus adeno-asociados es un nuevo serotipo, denominado en la presente memoria serotipo 7 (AAV7) . Otros novedosos serotipos de virus adeno-asociados proporcionados en la presente memoria incluyen el AA10, el AAV11 y el AAV12. Otros serotipos novedosos adicionales de AAV identificados conforme a los métodos descritos en la presente memoria, se proporcionan mediante la presente especificación. Véase, Figuras y Listado de Secuencias, lo que se ha incorporado en la presente por referencia.

También se proporcionan fragmentos de esas secuencias de AAV. Entre los fragmentos de AAV particularmente deseables están las proteínas cap, incluyendo la vp1, vp2, vp3, las regiones hipervariables, las proteínas rep, incluyendo la rep 78, rep 68, rep 52, y rep 40, y las secuencias que codifican estas proteínas. Cada uno de esos fragmentos puede ser utilizado fácilmente en una diversidad de sistemas de vector y de células anfitrión. Tales fragmentos pueden ser usados por sí solos, en combinación con otras secuencias o fragmentos de AAV, o en combinación con elementos procedentes de otras secuencias virales de AAV o no de AAV. En una realización particularmente deseable, un vector contiene las secuencias cap y/o rep de AAV de la invención.

Según se describe en la presente memoria, los alineamientos se realizan usando una diversidad de Programas de Alineamiento de Secuencia Múltiple, disponibles pública o comercialmente, tal como el “Clustal W” accesible a través de Servidores WEB por Internet. Alternativamente, se utilizan también las utilidades Vector NTI. Existe un número de algoritmos conocidos en la técnica que pueden ser usados para medir identidad de secuencia de nucleótido, incluyendo los contenidos en los programas descritos en lo que antecede. Según otro ejemplo, se pueden comparar secuencias de polinucleótido usando Fasta, un programa en GCG Versión 6.1. Fasta proporciona alineamientos y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones de mejor superposición entre las secuencias de consulta y búsqueda. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de ácido nucleico puede ser determinado usando Fasta con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para matriz de puntuación) según se prevé en GCG Versión 6.1. Se encuentran disponibles programas similares para secuencias de aminoácidos, por ejemplo del programa “Clustal X”. En general, cualquiera de esos programas puede ser usado en configuraciones por defecto, aunque un experto en la materia puede alterar esas configuraciones según se precise. Alternativamente, un experto en la materia... [Seguir leyendo]

1. Un virus adeno-asociado (AAV) que comprende una cápside de AAV que comprende una vp1 de AAVrh10, que comprende aminoácidos 1 a 738 de SEQ ID Núm. 81 o una secuencia que es al menos un 95% idéntica a la misma, un minigén que tiene repeticiones terminales invertidas (ITRs) de AAV, y un gen heterólogo enlazado operativamente a secuencias reguladoras que dirigen su expresión en una célula anfitrión.

2. El AAV de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las secuencias de aminoácidos es al menos un 99% idéntica a los aminoácidos 1 a 738 de SEQ ID Núm. 81.

3. El AAV de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la proteína vp1 de AAVrh10 comprende la secuencia de aminoácidos 1 a 738 de SEQ ID Núm. 81.

4. El AAV de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las ITRs proceden de AAV2.

5. Un virus adeno-asociado (AAV) que comprende una cápside de AAV que comprende al menos vp3 de AAVrh10 que comprende la secuencia de aminoácidos de 203 a 738 de SEQ ID Núm. 81 o una secuencia al menos un 95% idéntica con la misma y un minigén que tiene repeticiones terminales invertidas (ITRs) de AAV, y un gen heterólogo enlazado operativamente a secuencias reguladoras que dirigen su expresión en una célula anfitrión.

6. El AAV de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la proteína vp3 de AAVrh10 comprende la secuencia de aminoácidos 203 a 738 de SEQ ID Núm. 81.

7. Una composición que comprende un AAV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y un portador fisiológicamente compatible.

8. Una proteína de cápside aislada que comprende una proteína de AAVrh10 seleccionada en el grupo consistente en:

proteína de cápside vp1, aminoácidos (aa) 1 a 738 de SEQ ID Núm. 81

proteína de cápside vp2, aa 138 a 738 de SEQ ID Núm. 81, y

proteína de cápside vp3, aa 203 a 738 de SEQ ID Núm. 81

9. Una molécula de ácido nucleico aislada o sintética que codifica una proteína de acuerdo con la reivindicación 8.

10. Una molécula de ácido nucleico aislada o sintética que codifica un fragmento de una proteína de cápside de virus adeno-asociado rh10, estando dicha molécula de ácido nucleico seleccionada en el grupo consistente en:

vp1, nt 845 a 3061 de SEQ ID Núm. 59;

vp2, nt 1256 a 3061 de SEQ ID Núm. 59, y

vp3, nt 1454 a 3061 de SEQ ID Núm. 59.

11. Una molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, en la que dicha molécula es un plásmido.

12. Una molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en la que dicha molécula comprende además un gen rep de AAV funcional.

13. Un método de generación de un virus adeno-asociado (AAV) recombinante, que comprende una cápside de serotipo rh10 de AAV que comprende las etapas de cultivar una célula anfitrión que contiene: (a) una molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 que codifica una cápside de virus adeno-asociado; (b) un gen rep funcional; (c) un minigén que comprende repeticiones terminales invertidas (ITRs) de AAV y un transgén; y, (d) funciones auxiliares suficientes para permitir el empaquetamiento del minigén en la proteína de cápside de AAV.

14. Una célula anfitrión in vitro que contiene un virus adeno-asociado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12.