Sensores de calcio y métodos para la detección de calcio libre intracelular.

Sensores de calcio y métodos para la detección de calcio libre intracelular.



La invención proporciona un sensor de calcio basado en una proteína de fusión que comprende (i) un primer dominio polipeptídico con capacidad de unir Ca2+, (ii) un segundo dominio polipeptídico de la secuencia SEQ ID NO: 1 (GFPuv) o una variante de la misma que mantenga dos máximos en su espectro de excitación y al menos un máximo en su espectro de emisión, y (iii) un péptido flexible que une el primer dominio y el segundo dominio de manera covalente. También proporciona un animal no humano transgénico que comprende la proteína de fusión. Asimismo, la invención proporciona métodos para detectar la concentración de calcio Ca2+ intracelular.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201330283.

Solicitante: UNIVERSIDAD DE VALLADOLID.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: ALONSO ALONSO,Mª Teresa, GARCÍA-SANCHO MARTÍN,Javier.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A01K67/027 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA.A01K CRIA; AVICULTURA, PISCICULTURA, APICULTURA; PESCA; OBTENCION DE ANIMALES, NO PREVISTA EN OTRO LUGAR; NUEVAS RAZAS DE ANIMALES.A01K 67/00 Cría u obtención de animales, no prevista en otro lugar; Nuevas razas de animales. › Nuevas razas de vertebrados.
  • C07K14/435 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de animales; de humanos.
  • G01N33/58 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › en los que intervienen sustancias marcadas (G01N 33/53 tiene prioridad).

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Fragmento de la descripción:

SENSORES DE CALCIO Y MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE CALCIO LIBRE INTRACELULAR

CAMPO DE LA TÉCNICA

La presente invención se relaciona con sensores de calcio libre intracelular (Ca2+) codificados genéticamente y, en particular, con proteínas de fusión que comprenden un dominio de unión a calcio y una proteína fluorescente. También se relaciona con métodos para la detección de Ca2+mediante el uso de sensores de calcio.

ANTECEDENTES

El calcio libre intracelular (Ca2+) está implicado en una gran variedad de procesos intracelulares, tanto citosólicos como subcelulares. El retículo endoplásmico (RE) es el principal reservorio celular de Ca2+ y su capacidad para captar y liberar Ca2+ hace que esta orgánulo tenga un papel fundamental en la homeostasis celular del calcio. Por otra parte, resultados recientes de los últimos años han demostrado interacciones entre la señal del Ca2+ proveniente del RE con la entrada de Ca2+ desde el medio extracelular, así como con la captación del calcio mitocondrial. Además, el Ca2+ del RE regula una serie de enzimas residentes en el RE implicadas en la síntesis y el procesamiento de proteínas, y la alteración de la homeostasis del RE provoca estrés reticular.

Habitualmente, se utilizan indicadores convencionales de Ca2+ citosólico para inferir el contenido de Ca2+ del RE pero para poder discriminar entre la señal citosólica y la procedente de los orgánulos es indispensable disponer de una medida directa y fiable del [Ca2+]RE. Bajo ciertas condiciones experimentales, los indicadores de Ca2+ sintéticos se pueden introducir en el RE, aunque la señal no es específica y previamente debe eliminarse el

indicador atrapado en otros compartimentos como el citosol (Hofer and Machen, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2598-2602) . La principal ventaja de los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECIs) es que se pueden diseñar para que sean dirigidos a localizaciones subcelulares específicas, como el RE, y, así evitar el problema de la localización errónea. Tanto proteínas fluorescentes como bioluminiscentes se han utilizado con éxito para medir la [Ca2+]RE. Desde que Kendall et al. describieran por vez primera la posibilidad de determinar la [Ca2+]RE, mediante el uso de acuorina modificada para ser dirigida al RE, este tipo de señales han demostrado ser una excelente herramienta para medir [Ca2+]RE y durante los últimos 20 años han generado una gran cantidad de valiosos resultados en el campo de la señalización por calcio en el RE. Su principal limitación es la baja emisión de luz que dificulta los ensayos de imagen en célula única así como la necesitad de reconstituir la acuorina mediante el uso del cofactor celenteracina.

Esto se ha visto compensado con el uso de los GECIs, también denominados proteínas fluorescentes indicadoras de calcio (FCIPs) . Estas están compuestas de una o dos proteínas fluorescentes fusionadas a un dominio de unión al calcio. Los primeros se construyeron originalmente insertando calmodulina (Miyawaki et al., 1997, Nature 388: 882-887) , troponina (Heim and Griesbeck, 2004, J. Biol. Chem., 279:14280-14286) o incluso sólo un único motivo de mano EF en un sitio sensible dentro de la proteína fluorescente (Zou et al., 2007, Biochemistr y , 46:12275-12288) . El avance más reciente está basado en el diseño de un sitio de unión a calcio en la proteína EGFP (enhanced GFP) en la proximidad del fluoróforo (Tang et al., 2011, Proc. Natl. Acad. Sci. USA

108: 16265-70) . La proteína resultante es capaz de detectar calcio en altas concentraciones en el RE. En estos ejemplos, los cambios en la fluorescencia sensible al calcio se basan en los efectos producidos por el cambio 45 conformacional provocado por la unión del Ca2+ sobre el estado de protonación del cromóforo.

El gran progreso que se ha realizado en los últimos años en el diseño de nuevos GECIs no se corresponde con su funcionamiento in vivo, siendo casi todos los resultados publicados hasta la fecha insatisfactorios debido a los bajos niveles de expresión del transgén, que resulta en la inactivación del sensor o en un rango dinámico menor

que el obtenido in vitro (Kotlikoff, 2007, J. Physiol. 578:.55-67 y Whitaker, 2010, Methods Cell Biol 99:153-182) . De hecho, hasta la fecha sólo se ha publicado un único artículo sobre un modelo de ratón transgénico para el sensor Ca2+ del RE, el camaleón YC (Hara et al., 2004, "Imaging endoplasmic reticulum calcium with a fluorescent biosensor in transgenic mice." Am J Physiol Cell Physiol 287:C932-938) .

Por tanto, existe una gran necesidad en la técnica de proporcionar desarrollar biosensores que permitan la detección de Ca2+ en compartimentos con alta concentración de Ca2+ y que permitan su uso tanto in vivo como en animales transgénicos.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la invención se relaciona con un método para la determinación de la concentración de Ca2+ en una muestra que comprende (i) poner en contacto dicha muestra con una proteína de fusión que comprende (a) un primer dominio polipeptídico con capacidad de unir Ca2+, 65 (b) un segundo dominio polipeptídico fluorescente y en donde dicho primer y segundo dominio se encuentran unidos mediante un péptido enlazador flexible y en donde la unión de Ca2+ al primer dominio polipeptídico resulta en una modificación de las propiedades fluorescentes del segundo dominio polipeptídico y

(ii) detectar la fluorescencia emitida por dicho segundo dominio polipeptídico en respuesta a la excitación de la muestra a una longitud de onda correspondiente a la longitud de onda de excitación de dicho segundo dominio polipeptídico y

(iii) determinar la concentración de Ca2+ a partir de la variación en la intensidad de la fluorescencia con respecto a la intensidad de la fluorescencia en ausencia de Ca2+.

En un segundo aspecto, la invención se relaciona con un método para la detección intracelular de Ca2+ en una célula o población celular que comprende

(i) poner en contacto una célula o población celular que comprende una proteína de fusión que comprende

(a) un primer dominio polipeptídico con capacidad de unir Ca2+,

(b) un segundo dominio polipeptídico fluorescente en donde dicho primer y segundo dominio se encuentran unidos mediante un péptido enlazador flexible y en donde la unión de Ca2+ al primer dominio polipeptídico resulta en una modificación de las propiedades fluorescentes del segundo dominio polipeptídico y

(ii) detectar la fluorescencia emitida por dicho segundo dominio polipeptídico en respuesta a la excitación de la célula o población celular a una longitud de onda correspondiente a la longitud de onda de excitación de dicho segundo dominio polipeptídico

en donde una variación en la intensidad de la fluorescencia emitida por la célula o población celular con respecto a un valor de referencia es indicativo de la presencia de Ca2+ en la célula o población celular.

En un tercer aspecto, la invención se relaciona con un Método para la detección de variaciones en la concentración de Ca2+ intracelular en una célula o población celular a lo largo del tiempo que comprende

(i) proporcionar una célula o población celular en donde dicha célula o células comprenden una proteína de fusión que comprende

(a) un primer dominio polipeptídico con capacidad de unir Ca2+,

(b) un segundo dominio polipeptídico fluorescente y en donde dicho primer y segundo dominio se encuentran unidos mediante un péptido enlazador flexible y en donde la unión de Ca2+ al primer dominio polipeptídico resulta en una modificación de las propiedades fluorescentes del segundo dominio polipeptídico,

(ii) determinar a un primer tiempo la fluorescencia emitida por la célula o población celular en respuesta a una excitación de dicha célula o población a una longitud de onda correspondiente a la longitud de onda de excitación de dicho segundo dominio polipeptídico, y

(iii) determinar a un segundo tiempo la fluorescencia emitida por la célula o población celular en respuesta a una excitación de dicha célula o población a una longitud de onda correspondiente a la longitud de onda de excitación de dicho segundo dominio polipeptídico en donde una variación en la intensidad de la señal emitida en (iii) con respecto a la intensidad de la señal emitida en (ii) es indicativo de una variación en la concentración de Ca2+ en la célula o población celular.

En un cuarto aspecto, la invención se relaciona con un método de identificación de un compuesto con capacidad de modulación de la concentración de Ca2+ en una célula o población celular, que comprende... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para la determinación de la concentración de Ca2+ en una muestra que comprende (i) poner en contacto dicha muestra con una proteína de fusión que comprende

(a) un primer dominio polipeptídico con capacidad de unir Ca2+,

(b) un segundo dominio polipeptídico fluorescente y en donde -dicho primer y segundo dominio se encuentran unidos mediante un péptido enlazador

flexible,

-la unión de Ca2+ al primer dominio polipeptídico resulta en una modificación de las propiedades fluorescentes del segundo dominio polipeptídico,

-el primer dominio polipeptídico se selecciona del grupo formado por una mano EF, el pseudodominio de mano EF, los dominios con similitud a la mano EF, el dominio dockerina, o una proteína seleccionada del grupo formado por calmodulina, troponina C, calcineurina, proteína homóloga a calcineurina (CHP) , albúmina, parvalbúmina, integrinas, cadena ligera reguladora de miosina, proteínas S-100, calbindina, calretinina, anexinas, sorcina, calpaína, grancalcina, calsecuestrina, osteocalcina, osteonectina, sinaptotagmina, proteína de unión a calcio dependiente de vitamina D, espectrina, recoverina, hipocalcina, caltractina, esquidulina, tricohialina, hornerina, la proteína de unión a D-galactosa (GBP) , acuorina y apoacuorina, obelina y apoobelina, mitrocomina, berovina, clitina, y endoglucanasa, y

- el segundo dominio polipeptídico fluorescente se selecciona del grupo formado por proteína verde fluorescente (GFP o wtGFP) , Superfolder GFP, proteína fluorescente azul (EBFP) , cyan (ECFP) , y amarilla (YFP) , GFPuv, Emerald, mPlum, mCherr y , tdTomato, mStrawberr y , J-Red, mOrange, mKO, YFP, EYFP, mCitrine, Venus, YPet, CyPet, CFP, ECFP, mCFPm, Cerulean, T-Sapphire, proteína roja fluorescente (RFP) , DsRed, DsRed2, DsRed-Express, RedStar, HcRed1, Kaede, EosFP y proteína fluorescente Kindling (KFP) ;

(ii) detectar la fluorescencia emitida por dicho segundo dominio polipeptídico en respuesta a la excitación de la muestra a una longitud de onda correspondiente a la longitud de onda de excitación de dicho segundo dominio polipeptídico; y

(iii) determinar la concentración de Ca2+ a partir de la variación en la intensidad de la fluorescencia con respecto a la intensidad de la fluorescencia en ausencia de Ca2+.

2. Método para la detección intracelular de Ca2+ en una célula o población celular que comprende (i) poner en contacto una célula o población celular que comprende una proteína de fusión que comprende

(a) un primer dominio polipeptídico con capacidad de unir Ca2+,

(b) un segundo dominio polipeptídico fluorescente en donde -dicho primer y segundo dominio se encuentran unidos mediante un péptido enlazador

flexible,

-la unión de Ca2+ al primer dominio polipeptídico resulta en una modificación de las propiedades fluorescentes del segundo dominio polipeptídico,

-el primer dominio polipeptídico se selecciona del grupo formado por una mano EF, el pseudodominio de mano EF, los dominios con similitud a la mano EF, el dominio dockerina, o una proteína seleccionada del grupo formado por calmodulina, troponina C, calcineurina, proteína homóloga a calcineurina (CHP) , albúmina, parvalbúmina, integrinas, cadena ligera reguladora de miosina, proteínas S-100, calbindina, calretinina, anexinas, sorcina, calpaína, grancalcina, calsecuestrina, osteocalcina, osteonectina, sinaptotagmina, proteína de unión a calcio dependiente de vitamina D, espectrina, recoverina, hipocalcina, caltractina, esquidulina, tricohialina, hornerina, la proteína de unión a D-galactosa (GBP) , acuorina y apoacuorina, obelina y apoobelina, mitrocomina, berovina, clitina, y endoglucanasa, y

-el segundo dominio polipeptídico fluorescente se selecciona del grupo formado por proteína verde fluorescente (GFP o wtGFP) , Superfolder GFP, proteína fluorescente azul (EBFP) , cyan (ECFP) , y amarilla (YFP) , GFPuv, Emerald, mPlum, mCherr y , tdTomato, mStrawberr y , J-Red, mOrange, mKO, YFP, EYFP, mCitrine, Venus, YPet, CyPet, CFP, ECFP, mCFPm, Cerulean, T-Sapphire, proteína roja fluorescente (RFP) , DsRed, DsRed2, DsRed-Express, RedStar, HcRed1, Kaede, EosFP y proteína fluorescente Kindling (KFP) ;

y

(ii) detectar la fluorescencia emitida por dicho segundo dominio polipeptídico en respuesta a la excitación de la célula o población celular a una longitud de onda correspondiente a la longitud de onda de excitación de dicho segundo dominio polipeptídico en donde una variación en la intensidad de la fluorescencia emitida por la célula o población celular con respecto a un valor de referencia es indicativo de la presencia de Ca2+ en la célula o población celular.

3. Método la reivindicación 2 en donde la proteína de fusión se localiza en un compartimento intracelular u orgánulo específico.

4. Método según la reivindicación 3 en donde dicho compartimento intracelular u orgánulo específico se selecciona del grupo formado por retículo endoplásmico o sarcoplásmico, núcleo, aparato de Golgi y mitocondria.

5. Método según la reivindicación 4 en donde dicha proteína de fusión comprende una primera secuencia señal de direccionamiento a la ruta secretora y una segunda señal de retención en el retículo endoplásmico.

6. Método según la reivindicación 5 en donde la señal de retención en el retículo endoplásmico se selecciona del grupo consistente en un péptido de retención en el retículo endoplásmico en posición carboxilo terminal y una secuencia de interacción con BiP.

7. Método según la reivindicación 6 en donde la secuencia señal de direccionamiento a la ruta secretora se selecciona del grupo consistente en la secuencia señal de la calreticulina y la secuencia señal de la inmunoglobulina Igγ2b, en donde el péptido de retención en el retículo endoplásmico es el péptido KDEL (SEQ ID NO: 48) y/o en donde la secuencia interacción con BiP comprende los dominios VDJ y CH1 de la cadena pesada de la inmunoglobulina Igγ2b.

8. Método según la reivindicación 4 en donde la secuencia de localización es una secuencia de localización nuclear que comprende la secuencia de localización nuclear de nucleoplasmina.

9. Método según la reivindicación 4 en donde la secuencia de localización es una secuencia de localización al complejo de Golgi que comprende la secuencia de localización en el complejo de Golgi de galactosil transferasa.

10. Método según la reivindicación 4 en donde la secuencia de localización es una secuencia de localización a la mitocondria que comprende la secuencia de localización mitocondrial de la citocromo oxidasa VIII.

11. Método para la detección de variaciones en la concentración de Ca2+ intracelular en una célula o población celular a lo largo del tiempo que comprende

(i) proporcionar una célula o población celular en donde dicha célula o células comprenden una proteína de fusión que comprende

(a) un primer dominio polipeptídico con capacidad de unir Ca2+,

(b) un segundo dominio polipeptídico fluorescente y en donde -dicho primer y segundo dominio se encuentran unidos mediante un péptido enlazador

flexible,

-la unión de Ca2+ al primer dominio polipeptídico resulta en una modificación de las propiedades fluorescentes del segundo dominio polipeptídico,

-el primer dominio polipeptídico se selecciona del grupo formado por una mano EF, el pseudodominio de mano EF, los dominios con similitud a la mano EF, el dominio dockerina, o una proteína seleccionada del grupo formado por calmodulina, troponina C, calcineurina, proteína homóloga a calcineurina (CHP) , albúmina, parvalbúmina, integrinas, cadena ligera reguladora de miosina, proteínas S-100, calbindina, calretinina, anexinas, sorcina, calpaína, grancalcina, calsecuestrina, osteocalcina, osteonectina, sinaptotagmina, proteína de unión a calcio dependiente de vitamina D, espectrina, recoverina, hipocalcina, caltractina, esquidulina, tricohialina, hornerina, la proteína de unión a D-galactosa (GBP) , acuorina y apoacuorina, obelina y apoobelina, mitrocomina, berovina, clitina, y endoglucanasa, y

- el segundo dominio polipeptídico fluorescente se selecciona del grupo formado por proteína verde fluorescente (GFP o wtGFP) , Superfolder GFP, proteína fluorescente azul (EBFP) , cyan (ECFP) , y amarilla (YFP) , GFPuv, Emerald, mPlum, mCherr y , tdTomato, mStrawberr y , J-Red, mOrange, mKO, YFP, EYFP, mCitrine, Venus, YPet, CyPet, CFP, ECFP, mCFPm, Cerulean, T-Sapphire, proteína roja fluorescente (RFP) , DsRed, DsRed2, DsRed-Express, RedStar, HcRed1, Kaede, EosFP y proteína fluorescente Kindling (KFP) ,

(ii) determinar a un primer tiempo la fluorescencia emitida por la célula o población celular en respuesta a una excitación de dicha célula o población a una longitud de onda correspondiente a la longitud de onda de excitación de dicho segundo dominio polipeptídico y

(iii) determinar a un segundo tiempo la fluorescencia emitida por la célula o población celular en respuesta a una excitación de dicha célula o población a una longitud de onda correspondiente a la longitud de onda de excitación de dicho segundo dominio polipeptídico en donde una variación en la intensidad de la señal emitida en (iii) con respecto a la intensidad de la señal emitida en (ii) es indicativo de una variación en la concentración de Ca2+ en la célula o población celular.

12. Método la reivindicación 11 en donde la proteína de fusión se localiza en un compartimento intracelular u orgánulo específico.

13. Método según la reivindicación 12 en donde dicho compartimento intracelular u orgánulo específico se selecciona del grupo formado por retículo endoplásmico o sarcoplásmico, núcleo, aparato de Golgi y mitocondria.

14. Método según la reivindicación 13 en donde dicha proteína de fusión comprende una primera secuencia señal de direccionamiento a la ruta secretora y una segunda señal de retención en el retículo endoplásmico.

15. Método según la reivindicación 14 en donde la señal de retención en el retículo endoplásmico se selecciona del grupo consistente en un péptido de retención en el retículo endoplásmico en posición carboxilo terminal y una secuencia de interacción con BiP.

16. Método según la reivindicación 15 en donde la secuencia señal de direccionamiento a la ruta secretora se selecciona del grupo consistente en la secuencia señal de la calreticulina y la secuencia señal de la inmunoglobulina Igγ2b, en donde el péptido de retención en el retículo endoplásmico es el péptido KDEL (SEQ ID NO: 48) y/o en donde la secuencia interacción con BiP comprende los dominios VDJ y CH1 de la cadena pesada de la inmunoglobulina Igγ2b.

17. Método según la reivindicación 13 en donde la secuencia de localización es una secuencia de localización nuclear que comprende la secuencia de localización nuclear de nucleoplasmina.

18. Método según la reivindicación 13 en donde la secuencia de localización es una secuencia de localización al complejo de Golgi que comprende la secuencia de localización en el complejo de Golgi de galactosil transferasa.

19. Método según la reivindicación 13 en donde la secuencia de localización es una secuencia de localización a la mitocondria que comprende la secuencia de localización mitocondrial de la citocromo oxidasa VIII.

20. Método de identificación de un compuesto con capacidad de modulación de la concentración de Ca2+ en una célula o población celular, que comprende

(i) poner en contacto un compuesto candidato con una célula o población celular en donde dicha célula o población celular comprende una proteína de fusión que comprende

(a) un primer dominio polipeptídico con capacidad de unir Ca2+,

(b) un segundo dominio polipeptídico fluorescente y en donde -dicho primer y segundo dominio se encuentran unidos mediante un péptido enlazador

flexible,

-la unión de Ca2+ al primer dominio polipeptídico resulta en una modificación de las propiedades fluorescentes del segundo dominio polipeptídico, ,

-el primer dominio polipeptídico se selecciona del grupo formado por una mano EF, el pseudodominio de mano EF, los dominios con similitud a la mano EF, el dominio dockerina, o una proteína seleccionada del grupo formado por calmodulina, troponina C, calcineurina, proteína homóloga a calcineurina (CHP) , albúmina, parvalbúmina, integrinas, cadena ligera reguladora de miosina, proteínas S-100, calbindina, calretinina, anexinas, sorcina, calpaína, grancalcina, calsecuestrina, osteocalcina, osteonectina, sinaptotagmina, proteína de unión a calcio dependiente de vitamina D, espectrina, recoverina, hipocalcina, caltractina, esquidulina, tricohialina, hornerina, la proteína de unión a D-galactosa (GBP) , acuorina y apoacuorina, obelina y apoobelina, mitrocomina, berovina, clitina, y endoglucanasa, y

- el segundo dominio polipeptídico fluorescente se selecciona del grupo formado por proteína verde fluorescente (GFP o wtGFP) , Superfolder GFP, proteína fluorescente azul (EBFP) , cyan (ECFP) , y amarilla (YFP) , GFPuv, Emerald, mPlum, mCherr y , tdTomato, mStrawberr y , J-Red, mOrange, mKO, YFP, EYFP, mCitrine, Venus, YPet, CyPet, CFP, ECFP, mCFPm, Cerulean, T-Sapphire, proteína roja fluorescente (RFP) , DsRed, DsRed2, DsRed-Express, RedStar, HcRed1, Kaede, EosFP y proteína fluorescente Kindling (KFP) ,

(ii) determinar la fluorescencia emitida por la célula o población celular en respuesta a una excitación de dicha célula o población a una longitud de onda correspondiente a la longitud de onda de excitación de dicho segundo dominio polipeptídico,

en donde una alteración en la intensidad de fluorescencia determinada en la etapa (ii) con respecto a la intensidad de fluorescencia emitida en ausencia de dicho compuesto candidato es indicativo de que dicho compuesto es capaz de modular la concentración de Ca2+.

21. Método según la reivindicación 20 en donde la proteína de fusión se localiza en un compartimento intracelular u orgánulo específico.

22. Método según la reivindicación 21 en donde dicho compartimento intracelular u orgánulo específico se selecciona del grupo formado por retículo endoplásmico o sarcoplásmico, núcleo, aparato de Golgi y mitocondria.

23. Método según la reivindicación 22 en donde dicha proteína de fusión comprende una primera secuencia señal de direccionamiento a la ruta secretora y una segunda señal de retención en el retículo endoplásmico.

24. Método según la reivindicación 23 en donde la señal de retención en el retículo endoplásmico se selecciona del grupo consistente en un péptido de retención en el retículo endoplásmico en posición carboxilo terminal y una secuencia de interacción con BiP.

25. Método según la reivindicación 24 en donde la secuencia señal de direccionamiento a la ruta secretora se selecciona del grupo consistente en la secuencia señal de la calreticulina y la secuencia señal de la inmunoglobulina Igγ2b, en donde el péptido de retención en el retículo endoplásmico es el péptido KDEL (SEQ ID NO: 48) y/o en donde la secuencia interacción con BiP comprende los dominios VDJ y CH1 de la cadena pesada de la inmunoglobulina Igγ2b.

26. Método según la reivindicación 22 en donde la secuencia de localización es una secuencia de localización nuclear que comprende la secuencia de localización nuclear de nucleoplasmina.

27. Método según la reivindicación 22 en donde la secuencia de localización es una secuencia de localización al complejo de Golgi que comprende la secuencia de localización en el complejo de Golgi de galactosil transferasa.

28. Método según la reivindicación 22 en donde la secuencia de localización es una secuencia de localización a la mitocondria que comprende la secuencia de localización mitocondrial de la citocromo oxidasa VIII.

29. Método para la detección de Ca2+ en un animal que comprende

(i) proporcionar un animal no humano transgénico no humano transgénico que comprende un polinucleótido que permite la expresión en dicho animal de una proteína de fusión que comprende

(a) un primer dominio polipeptídico con capacidad de unir Ca2+,

(b) un segundo dominio polipeptídico fluorescente y en donde -dicho primer y segundo dominio se encuentran unidos mediante un péptido enlazador

flexible,

-la unión de Ca2+ al primer dominio polipeptídico resulta en una modificación de las propiedades fluorescentes del segundo dominio polipeptídico, ,

-el primer dominio polipeptídico se selecciona del grupo formado por una mano EF, el pseudodominio de mano EF, los dominios con similitud a la mano EF, el dominio dockerina, o una proteína seleccionada del grupo formado por calmodulina, troponina C, calcineurina, proteína homóloga a calcineurina (CHP) , albúmina, parvalbúmina, integrinas, cadena ligera reguladora de miosina, proteínas S-100, calbindina, calretinina, anexinas, sorcina, calpaína, grancalcina, calsecuestrina, osteocalcina, osteonectina, sinaptotagmina, proteína de unión a calcio dependiente de vitamina D, espectrina, recoverina, hipocalcina, caltractina, esquidulina, tricohialina, hornerina, la proteína de unión a D-galactosa (GBP) , acuorina y apoacuorina, obelina y apoobelina, mitrocomina, berovina, clitina, y endoglucanasa, y

- el segundo dominio polipeptídico fluorescente se selecciona del grupo formado por proteína verde fluorescente (GFP o wtGFP) , Superfolder GFP, proteína fluorescente azul (EBFP) , cyan (ECFP) , y amarilla (YFP) , GFPuv, Emerald, mPlum, mCherr y , tdTomato, mStrawberr y , J-Red, mOrange, mKO, YFP, EYFP, mCitrine, Venus, YPet, CyPet, CFP, ECFP, mCFPm, Cerulean, T-Sapphire, proteína roja fluorescente (RFP) , DsRed, DsRed2, DsRed-Express, RedStar, HcRed1, Kaede, EosFP y proteína fluorescente Kindling (KFP)

y

(ii) determinar de forma no invasiva la emisión fluorescente en dicho animal.

30. Método la reivindicación 29 en donde la proteína de fusión se localiza en un compartimento intracelular u orgánulo específico.

31. Método según la reivindicación 30 en donde dicho compartimento intracelular u orgánulo específico se selecciona del grupo formado por retículo endoplásmico o sarcoplásmico, núcleo, aparato de Golgi y mitocondria.

32. Método según la reivindicación 31 en donde dicha proteína de fusión comprende una primera secuencia señal de direccionamiento a la ruta secretora y una segunda señal de retención en el retículo endoplásmico.

33. Método según la reivindicación 32 en donde la señal de retención en el retículo endoplásmico se selecciona del grupo consistente en un péptido de retención en el retículo endoplásmico en posición carboxilo terminal y una secuencia de interacción con BiP.

34. Método según la reivindicación 33 en donde la secuencia señal de direccionamiento a la ruta secretora se selecciona del grupo consistente en la secuencia señal de la calreticulina y la secuencia señal de la inmunoglobulina Igγ2b, en donde el péptido de retención en el retículo endoplásmico es el péptido KDEL (SEQ ID NO: 48) y/o en donde la secuencia interacción con BiP comprende los dominios VDJ y CH1 de la cadena pesada de la inmunoglobulina Igγ2b.

35. Método según la reivindicación 31 en donde la secuencia de localización es una secuencia de localización nuclear que comprende la secuencia de localización nuclear de nucleoplasmina.

36. Método según la reivindicación 31 en donde la secuencia de localización es una secuencia de localización al complejo de Golgi que comprende la secuencia de localización en el complejo de Golgi de galactosil transferasa.

37. Método según la reivindicación 31 en donde la secuencia de localización es una secuencia de localización a la mitocondria que comprende la secuencia de localización mitocondrial de la citocromo oxidasa VIII.

38. Método de identificación de un compuesto con capacidad de modulación de la concentración de Ca2+ en un animal no humano transgénico que comprende

(i) poner en contacto un compuesto candidato con un animal no humano transgénico que comprende in polinucleótido que permite la expresión en dicho animal de una proteína de fusión que comprende

(a) un primer dominio polipeptídico con capacidad de unir Ca2+,

(b) un segundo dominio polipeptídico fluorescente y en donde -dicho primer y segundo dominio se encuentran unidos mediante un péptido enlazador

flexible, -la unión de Ca2+ al primer dominio polipeptídico resulta en una modificación de las propiedades fluorescentes del segundo dominio polipeptídico, ,

-el primer dominio polipeptídico se selecciona del grupo formado por una mano EF, el pseudodominio de mano EF, los dominios con similitud a la mano EF, el dominio dockerina, o una proteína seleccionada del grupo formado por calmodulina, troponina C, calcineurina, proteína homóloga a calcineurina (CHP) , albúmina, parvalbúmina, integrinas, cadena ligera reguladora de miosina, proteínas S-100, calbindina, calretinina, anexinas, sorcina, calpaína, grancalcina, calsecuestrina, osteocalcina, osteonectina, sinaptotagmina, proteína de unión a calcio dependiente de vitamina D, espectrina, recoverina, hipocalcina, caltractina, esquidulina, tricohialina, hornerina, la proteína de unión a D-galactosa (GBP) , acuorina y apoacuorina, obelina y apoobelina, mitrocomina, berovina, clitina, y endoglucanasa, y

- el segundo dominio polipeptídico fluorescente se selecciona del grupo formado por proteína verde fluorescente (GFP o wtGFP) , Superfolder GFP, proteína fluorescente azul (EBFP) , cyan (ECFP) , y amarilla (YFP) , GFPuv, Emerald, mPlum, mCherr y , tdTomato, mStrawberr y , J-Red, mOrange, mKO, YFP, EYFP, mCitrine, Venus, YPet, CyPet, CFP, ECFP, mCFPm, Cerulean, T-Sapphire, proteína roja fluorescente (RFP) , DsRed, DsRed2, DsRed-Express, RedStar, HcRed1, Kaede, EosFP y proteína fluorescente Kindling (KFP) ,

(ii) determinar de forma no invasiva la fluorescencia emitida por el animal transgénico en respuesta a una excitación a una longitud de onda correspondiente a la longitud de onda de excitación de dicho segundo dominio polipeptídico,

en donde una alteración en la intensidad de fluorescencia determinada en la etapa (ii) con respecto a la intensidad de fluorescencia emitida en ausencia de dicho compuesto candidato es indicativo de que dicho compuesto es capaz de modular la concentración de Ca2+.

39. Método la reivindicación 38 en donde la proteína de fusión se localiza en un compartimento intracelular u orgánulo específico.

40. Método según la reivindicación 39 en donde dicho compartimento intracelular u orgánulo específico se selecciona del grupo formado por retículo endoplásmico o sarcoplásmico, núcleo, aparato de Golgi y mitocondria.

41. Método según la reivindicación 40 en donde dicha proteína de fusión comprende una primera secuencia señal de direccionamiento a la ruta secretora y una segunda señal de retención en el retículo endoplásmico.

42. Método según la reivindicación 41 en donde la señal de retención en el retículo endoplásmico se selecciona del grupo consistente en un péptido de retención en el retículo endoplásmico en posición carboxilo terminal y una secuencia de interacción con BiP.

43. Método según la reivindicación 42 en donde la secuencia señal de direccionamiento a la ruta secretora se selecciona del grupo consistente en la secuencia señal de la calreticulina y la secuencia señal de la inmunoglobulina Igγ2b, en donde el péptido de retención en el retículo endoplásmico es el péptido KDEL (SEQ ID NO: 48) y/o en donde la secuencia interacción con BiP comprende los dominios VDJ y CH1 de la cadena pesada de la inmunoglobulina Igγ2b.

44. Método según la reivindicación 40 en donde la secuencia de localización es una secuencia de localización nuclear que comprende la secuencia de localización nuclear de nucleoplasmina.

45. Método según la reivindicación 40 en donde la secuencia de localización es una secuencia de localización al complejo de Golgi que comprende la secuencia de localización en el complejo de Golgi de galactosil transferasa.

46. Método según la reivindicación 40 en donde la secuencia de localización es una secuencia de localización a la mitocondria que comprende la secuencia de localización mitocondrial de la citocromo oxidasa VIII.

47. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 46, en donde el primer dominio polipeptídico con capacidad de unir Ca2+ de dicha proteína de fusión es apoacuorina (SEQ ID NO: 2) o una variante funcionalmente activa de la misma.

48. Método según la reivindicación 47 en donde la variante funcionalmente equivalente de la apoacuorina muestra una afinidad por Ca2+ reducida con respecto a la apoacuorina.

49. Método según la reivindicación 48 en donde la variante de apoacuorina que muestra una afinidad para Ca2+ reducida con respecto a la apoacuorina tiene al menos una mutación seleccionada del grupo de D117A, D119A y D163A.

50. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 49, en donde el segundo dominio polipeptídico comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 (GFPuv) o una variante funcionalmente equivalente de dicha secuencia.

51. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 50 en donde el péptido enlazador es un péptido con secuencia SEQ ID NO: 3, o variantes o fragmentos del mismo.

52. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 51, en donde el segundo dominio polipeptídico comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 (GFPuv) o una variante funcionalmente equivalente de dicha secuencia y en donde la longitud de onda de excitación se encuentra en un rango de entre aproximadamente 373 nm y aproximadamente 433 nm o en un rango de entre aproximadamente 440 nm y aproximadamente 500 nm.

53. Método según la reivindicación 52 en donde la longitud de onda de excitación se selecciona del grupo de 403 y 470 nm.

54. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 53 en donde el segundo dominio polipeptídico comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 (GFPuv) y en donde la longitud de onda de emisión se encuentra en un rango de entre aproximadamente 480 nm y aproximadamente 540 nm.

55. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 54, que comprende además

(i) determinar la fluorescencia a una segunda longitud de onda correspondiente a una segunda longitud de onda de excitación del segundo dominio polipeptídico fluorescente de dicha proteína de fusión, y que es diferente de la primera longitud de onda de excitación del mismo y

(ii) comparar la señal con una señal de referencia, en donde una intensidad de la señal emitida alterada con respecto a una señal de referencia es indicativo de la presencia de Ca2+ en dicha célula o población celular.

56. Método según la reivindicación 55, en donde se determina la relación de la intensidad de la señal emitida en respuesta a excitación a la primera y la segunda longitudes de onda correspondientes a la primera y la segunda longitudes de onda de excitación del al menos un segundo dominio polipeptídico fluorescente.

57. Método según cualquiera la reivindicación 55 o 56, en donde el segundo dominio polipeptídico comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 (GFPuv) o una variante funcionalmente equivalente de dicha secuencia y en donde la primera longitud de onda de excitación se encuentra en un rango de entre aproximadamente 373 nm y aproximadamente 433 nm y la segunda longitud de onda de excitación se encuentra en un rango de entre aproximadamente 440 nm y aproximadamente 500 nm, o en donde la primera longitud de onda de excitación se encuentra en el rango entre aproximadamente 440 nm y 500 aproximadamente nm y la segunda longitud de onda de excitación se encuentra en el rango entre aproximadamente 373 nm y aproximadamente 433 nm.

58. Método según la reivindicación 57, en donde la primera longitud de onda de excitación es aproximadamente de 403 nm y la segunda longitud de onda de excitación es aproximadamente de 470 nm, o en donde la primera longitud de onda de excitación es aproximadamente de 470 nm y la segunda longitud de onda de excitación es aproximadamente de 403 nm.

59. Método según cualquiera de las reivindicaciones 55 a 58, en donde el segundo dominio polipeptídico comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 (GFPuv) y en donde la longitud de onda de emisión se encuentra en un rango de entre aproximadamente 480 nm y aproximadamente 540 nm.

60. Método según la reivindicación 59, en donde la longitud de onda de emisión es aproximadamente de 510 nm.

2+2+

Fig. 1 Fig. 2 Fig. 3 Fig. 4 Fig. 5 Fig. 6


 

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