Sensores de calcio y métodos para la detección de calcio libre intracelular.

Sensores de calcio y métodos para la detección de calcio libre intracelular.



La invención proporciona un sensor de calcio basado en una proteína de fusión que comprende (i) un primer dominio polipeptídico con capacidad de unir Ca2+, (ii) un segundo dominio polipeptídico de la secuencia SEQ ID NO: 1 (GFPuv) o una variante de la misma que mantenga dos máximos en su espectro de excitación y al menos un máximo en su espectro de emisión, y (iii) un péptido flexible que une el primer dominio y el segundo dominio de manera covalente. También proporciona un animal no humano transgénico que comprende la proteína de fusión. Asimismo, la invención proporciona métodos para detectar la concentración de calcio Ca2+ intracelular.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201230475.

Solicitante: UNIVERSIDAD DE VALLADOLID.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: ALONSO ALONSO,Mª Teresa, GARCÍA-SANCHO MARTÍN,Javier.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K1/13 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 1/00 Procedimientos generales de preparación de péptidos. › Marcaje de péptidos.
  • C07K14/47 C07K […] › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de mamíferos.

PDF original: ES-2427854_A1.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Sensores de calcio y métodos para la detección de calcio libre intracelular

CAMPO DE LA TÉCNICA

La presente invención se relaciona con sensores de calcio libre intracelular (Ca2+) codificados genéticamente y, en particular, con proteínas de fusión que comprenden un dominio de unión a calcio y una proteína fluorescente. También se relaciona con métodos para la detección de Ca2+mediante el uso de sensores de calcio.

ANTECEDENTES

El calcio libre intracelular (Ca2+) está implicado en una gran variedad de procesos intracelulares, tanto citosólicos como subcelulares. El retículo endoplásmico (RE) es el principal reservorio celular de Ca2+ y su capacidad para captar y liberar Ca2+ hace que esta orgánulo tenga un papel fundamental en la homeostasis celular del calcio. Por otra parte, resultados recientes de los últimos años han demostrado interacciones entre la señal del Ca2+ proveniente del RE con la entrada de Ca2+ desde el medio extracelular, así como con la captación del calcio mitocondrial. Además, el Ca2+ del RE regula una serie de enzimas residentes en el RE implicadas en la síntesis y el procesamiento de proteínas, y la alteración de la homeostasis del RE provoca estrés reticular.

Habitualmente, se utilizan indicadores convencionales de Ca2+ citosólico para inferir el contenido de Ca2+ del RE pero para poder discriminar entre la señal citosólica y la procedente de los orgánulos es indispensable disponer de una medida directa y fiable del [Ca2+]RE. Bajo ciertas condiciones experimentales, los indicadores de Ca2+ sintéticos se pueden introducir en el RE, aunque la señal no es específica y previamente debe eliminarse el indicador atrapado en otros compartimentos como el citosol (Hofer and Machen, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2598-2602) . La principal ventaja de los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECIs) es que se pueden diseñar para que sean dirigidos a localizaciones subcelulares específicas, como el RE, y, así evitar el problema de la localización errónea. Tanto proteínas fluorescentes como bioluminiscentes se han utilizado con éxito para medir la [Ca2+]RE. Desde que Kendall et al. describieran por vez primera la posibilidad de determinar la [Ca2+]RE, mediante el uso de acuorina modificada para ser dirigida al RE, este tipo de señales han demostrado ser una excelente herramienta para medir [Ca2+]RE y durante los últimos 20 años han generado una gran cantidad de valiosos resultados en el campo de la señalización por calcio en el RE. Su principal limitación es la baja emisión de luz que dificulta los ensayos de imagen en célula única así como la necesitad de reconstituir la acuorina mediante el uso del cofactor celenteracina.

Esto se ha visto compensado con el uso de los GECIs, también denominados proteínas fluorescentes indicadoras de calcio (FCIPs) . Estas están compuestas de una o dos proteínas fluorescentes fusionadas a un dominio de unión al calcio. Los primeros se construyeron originalmente insertando calmodulina (Miyawaki et al., 1997, Nature 388: 882-887) , troponina (Heim and Griesbeck, 2004, J. Biol. Chem., 279:14280-14286) o incluso sólo un único motivo de mano EF en un sitio sensible dentro de la proteína fluorescente (Zou et al., 2007, Biochemistr y , 46:12275-12288) . El avance más reciente está basado en el diseño de un sitio de unión a calcio en la proteína EGFP (enhanced GFP) en la proximidad del fluoróforo (Tang et al., 2011, Proc. Natl. Acad. Sci. USA

108: 16265-70) . La proteína resultante es capaz de detectar calcio en altas concentraciones en el RE. En estos ejemplos, los cambios en la fluorescencia sensible al calcio se basan en los efectos producidos por el cambio conformacional provocado por la unión del Ca2+ sobre el estado de protonación del cromóforo.

El gran progreso que se ha realizado en los últimos años en el diseño de nuevos GECIs no se corresponde con su funcionamiento in vivo, siendo casi todos los resultados publicados hasta la fecha insatisfactorios debido a los bajos niveles de expresión del transgén, que resulta en la inactivación del sensor o en un rango dinámico menor que el obtenido in vitro (Kotlikoff, 2007, J. Physiol. 578:.55-67 y Whitaker, 2010, Methods Cell Biol 99:153-182) . De hecho, hasta la fecha sólo se ha publicado un único artículo sobre un modelo de ratón transgénico para el sensor Ca2+ del RE, el camaleón YC (Hara et al., 2004, "Imaging endoplasmic reticulum calcium with a fluorescent biosensor in transgenic mice." Am J Physiol Cell Physiol 287:C932-938) .

Por tanto, existe una gran necesidad en la técnica de proporcionar desarrollar biosensores que permitan la detección de Ca2+ en compartimentos con alta concentración de Ca2+ y que permitan su uso tanto in vivo como en animales transgénicos.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la invención se relaciona con una proteína de fusión que comprende

(i) un primer dominio polipeptídico con capacidad de unir Ca2+ y

(ii) un segundo dominio polipeptídico que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 (GFPuv) o una variante funcionalmente equivalente de dicha secuencia,

en donde dichos primer y segundo dominios se encuentran unidos a través de un péptido enlazador flexible y en donde la unión de Ca2+ al primer dominio polipeptídico induce un cambio en las propiedades fluorescentes del segundo dominio polipeptídico y

en donde el primer dominio polipeptídico se selecciona del grupo formado por una mano EF, el pseudodominio de mano EF, los dominios con similitud a la mano EF, el dominio dockerina, o una proteína seleccionada del grupo formado por calmodulina, troponina C, calcineurina, proteína homóloga a calcineurina (CHP) , albúmina, parvalbúmina, integrinas, cadena ligera reguladora de miosina, proteínas S-100, calbindina, calretinina, anexinas, sorcina, calpaína, grancalcina, calsecuestrina, osteocalcina, osteonectina, sinaptotagmina, proteína de unión a calcio dependiente de vitamina D, espectrina, recoverina, hipocalcina, caltractina, esquidulina, tricohialina, hornerina, la proteína de unión a D-galactosa (GBP) , acuorina y apoacuorina, obelina y apo-obelina, mitrocomina, berovina, clitina, y endoglucanasa.

En un segundo aspecto, la invención se relaciona con el uso de la proteína de fusión según el primer aspecto de la invención para la detección de Ca2+ en una muestra.

En un tercer aspecto, la invención se relaciona con un animal no humano transgénico que comprende un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión según el primer aspecto de la invención y en donde dicho ácido nucleico está insertado en su genoma.

En un cuarto aspecto, la invención se relaciona con el uso del animal no humano transgénico según el tercer aspecto de la invención para la identificación de compuestos con capacidad de modulación de la concentración de Ca2+.

En un quinto aspecto, la invención se relaciona con un método para la determinación de la concentración de Ca2+ en una muestra que comprende

(i) poner en contacto dicha muestra con una proteína de fusión de acuerdo con el primer aspecto de la invención y

(ii) detectar la fluorescencia emitida por dicho segundo dominio polipeptídico en respuesta a la excitación de la muestra a una longitud de onda correspondiente a la longitud de onda de excitación de dicho segundo dominio polipeptídico y

(iii) determinar la concentración de Ca2+ a partir de la variación en la intensidad de la fluorescencia con respecto a la intensidad de la fluorescencia en ausencia de Ca2+.

En un sexto aspecto, la invención se relaciona con un método para la detección intracelular de Ca2+ en una célula o población celular que comprende

(i) poner en contacto una célula o población celular que comprende una proteína de fusión de acuerdo con el primer aspecto de la invencióny

(ii) detectar la fluorescencia emitida por dicho segundo dominio polipeptídico en respuesta a la excitación de la célula o población celular a una longitud de onda correspondiente a la longitud de onda de excitación de dicho segundo dominio polipeptídico

en donde una variación en la intensidad de la fluorescencia emitida por la célula o población celular con respecto a un valor de referencia es indicativo de la presencia de Ca2+ en la célula o población celular.

En un séptimo aspecto, la invención se relaciona con un Método para la detección de variaciones en la concentración de Ca2+ intracelular en una célula o población celular a lo largo del tiempo que comprende

(i) proporcionar una célula o población celular en donde dicha célula o células comprenden una proteína de fusión de acuerdo con... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

2. Proteína de fusión que comprende

(i) un primer dominio polipeptídico con capacidad de unir Ca2+ y

(ii) un segundo dominio polipeptídico que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 (GFPuv) o una variante funcionalmente equivalente de dicha secuencia,

en donde dichos primer y segundo dominios se encuentran unidos a través de un péptido enlazador flexible,

en donde la unión de Ca2+ al primer dominio polipeptídico induce un cambio en las propiedades fluorescentes del segundo dominio polipeptídico y

en donde el primer dominio polipeptídico se selecciona del grupo formado por una mano EF, el pseudodominio de mano EF, los dominios con similitud a la mano EF, el dominio dockerina, o una proteína seleccionada del grupo formado por calmodulina, troponina C, calcineurina, proteína homóloga a calcineurina (CHP) , albúmina, parvalbúmina, integrinas, cadena ligera reguladora de miosina, proteínas S100, calbindina, calretinina, anexinas, sorcina, calpaína, grancalcina, calsecuestrina, osteocalcina, osteonectina, sinaptotagmina, proteína de unión a calcio dependiente de vitamina D, espectrina, recoverina, hipocalcina, caltractina, esquidulina, tricohialina, hornerina, la proteína de unión a D-galactosa (GBP) , acuorina y apoacuorina, obelina y apo-obelina, mitrocomina, berovina, clitina, y endoglucanasa.

3. Proteína de fusión según la reivindicación 1, en donde el primer dominio polipeptídico (i) es apoacuorina (SEQ ID NO: 2) o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

4. Proteína de fusión según la reivindicación 2 en donde la variante funcionalmente equivalente de la apoacuorina muestra una afinidad para Ca2+ reducida con respecto a la apoacuorina.

5. Proteína de fusión según la reivindicación 3 en donde la variante de apoacuorina que muestra una afinidad para Ca2+ reducida con respecto a la apoacuorina tiene al menos una mutación seleccionada del grupo de D117A, D119A y D163A.

6. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el péptido enlazador es un péptido con secuencia SEQ ID NO: 3.

7. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende adicionalmente al menos una secuencia de localización en un compartimento intracelular u orgánulo específico.

8. Proteína de fusión según la reivindicación 6 en donde la secuencia de localización se selecciona del grupo consistente en una secuencia de localización en el retículo endoplásmico, una secuencia de señalización mitocondrial, una secuencia de localización nuclear y una secuencia de señalización en el complejo de Golgi.

9. Proteína de fusión según la reivindicación 7 que comprende una primera secuencia señal de direccionamiento a la ruta secretora y una segunda señal de retención en el retículo endoplásmico.

10. Proteína de fusión según la reivindicación 8 en la señal de retención en el retículo endoplásmico se selecciona del grupo consistente en un péptido de retención en el retículo endoplásmico en posición carboxilo terminal y una secuencia de interacción con BiP.

11. Proteína de fusión según la reivindicación 9 en donde la secuencia señal de direccionamiento a la ruta secretora se selecciona del grupo consistente en la secuencia señal de la calreticulina y la secuencia señal de la inmunoglobulina Igγ2b, en donde el péptido de retención en el retículo endoplásmico es el péptido KDEL (SEQ ID NO: 48) y/o en donde la secuencia interacción con BiP comprende los dominios VDJ y CH1 de la cadena pesada de la inmunoglobulina Igγ2b.

12. Proteína de fusión según la reivindicación 6 en donde la secuencia de localización es una secuencia de localización nuclear que comprende la secuencia de localización nuclear de nucleoplasmina.

13. Proteína de fusión según la reivindicación 6 en donde la secuencia de localización es una secuencia de localización al complejo de Golgi que comprende la secuencia de localización en el complejo de Golgi de galactosil transferasa.

14. Proteína de fusión según la reivindicación 6 en donde la secuencia de localización es una secuencia de localización a la mitocondria que comprende la secuencia de localización mitocondrial de la citocromo oxidasa VIII.

15. Ácido nucleico que codifica para la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

16. Casete de expresión que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 14, donde dicho ácido nucleico se encuentra bajo control de un sistema de transcripción y/o traducción apropiado.

17. Plásmido que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 14 o el casete de expresión según la reivindicación 15.

18. Célula hospedadora que comprende ácido nucleico según la reivindicación 14, el casete de expresión según la reivindicación 15, o el plásmido según la reivindicación 16.

19. Uso de la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la detección de Ca2+ en una muestra.

20. Animal no humano transgénico que comprende un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión según las reivindicaciones 1 a 13 y en donde dicho ácido nucleico está insertado en su genoma.

21. Animal no humano transgénico según la reivindicación 19 en donde el polinucleótido que codifica para dicha proteína de fusión está bajo control de un sistema de transcripción y/o traducción apropiado.

22. Animal no humano transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 19 o 20, en donde dicho ácido nucleico se encuentra operativamente acoplado a un promotor que permite su expresión regulada.

23. Animal no humano transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 en donde dicho promotor permite la expresión específica de tejido de dicha proteína de fusión.

24. Animal no humano transgénico según la reivindicación 20, en donde el promotor permite la expresión de la proteína de fusión en tejido nervioso.

25. Animal no humano transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22 en donde dicho promotor permite la expresión específica de tipo celular de dicha proteína de fusión.

26. Animal no humano transgénico según la reivindicación 22, en donde el promotor permite la expresión de la proteína de fusión en neuronas.

27. Animal no humano transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 25, en donde dicho animal es un mamífero.

28. Animal no humano transgénico según la reivindicación 26, en donde dicho mamífero es un ratón.

29. Uso del animal no humano transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 27 para la identificación de compuestos con capacidad de modulación de la concentración de Ca2+.

30. Método para la determinación de la concentración de Ca2+ en una muestra que comprende

(i) poner en contacto dicha muestra con una proteína de fusión según la reivindicación 1;

(ii) detectar la fluorescencia emitida por el segundo dominio polipeptídico fluorescente de dicha proteína de fusión en respuesta a la excitación de la muestra a una longitud de onda correspondiente a la longitud de onda de excitación de dicho segundo dominio polipeptídico; y

(iii) determinar la concentración de Ca2+ a partir de la variación en la intensidad de la fluorescencia con respecto a la intensidad de la fluorescencia en ausencia de Ca2+.

31. Método para la detección intracelular de Ca2+ en una célula o población celular que comprende

(i) poner en contacto una célula o población celular que comprende una proteína de fusión según la reivindicación 1

y

(ii) detectar la fluorescencia emitida por el segundo dominio polipeptídico fluorescente de dicha proteína de fusión en respuesta a la excitación de la célula o población celular a una longitud de onda correspondiente a la longitud de onda de excitación de dicho segundo dominio polipeptídico

en donde una variación en la intensidad de la fluorescencia emitida por la célula o población celular con respecto a un valor de referencia es indicativo de la presencia de Ca2+ en la célula o población celular.

32. Método la reivindicación 30 en donde la proteína de fusión se localiza en un compartimento intracelular u orgánulo específico.

33. Método según la reivindicación 31 en donde dicho compartimento intracelular u orgánulo específico se selecciona del grupo formado por retículo endoplásmico o sarcoplásmico, núcleo, aparato de Golgi y mitocondria.

34. Método para la detección de variaciones en la concentración de Ca2+ intracelular en una célula o población celular a lo largo del tiempo que comprende

(i) proporcionar una célula o población celular en donde dicha célula o células comprenden una proteína según la reivindicación 1,

(ii) determinar a un primer tiempo la fluorescencia emitida por la célula o población celular en respuesta a una excitación de dicha célula o población a una longitud de onda correspondiente a la longitud de onda de excitación de dicho segundo dominio polipeptídico y

(iii) determinar a un segundo tiempo la fluorescencia emitida por la célula o población celular en respuesta a una excitación de dicha célula o población a una longitud de onda correspondiente a la longitud de onda de excitación de dicho segundo dominio polipeptídico

en donde una variación en la intensidad de la señal emitida en (iii) con respecto a la intensidad de la señal emitida en (ii) es indicativo de una variación en la concentración de Ca2+ en la célula o población celular.

35. Método la reivindicación 33 en donde la proteína de fusión se localiza en un compartimento intracelular u orgánulo específico.

36. Método según la reivindicación 34 en donde dicho compartimento intracelular u orgánulo específico se selecciona del grupo formado por retículo endoplásmico o sarcoplásmico, núcleo, aparato de Golgi y mitocondria.

37. Método de identificación de un compuesto con capacidad de modulación de la concentración de Ca2+ en una célula o población celular, que comprende

(i) poner en contacto un compuesto candidato con una célula o población celular en donde dicha célula o población celular comprende una proteína de fusión según la reivindicación 1,

(ii) determinar la fluorescencia emitida por la célula o población celular en respuesta a una excitación de dicha célula o población a una longitud de onda correspondiente a la longitud de onda de excitación de dicho segundo dominio polipeptídico,

en donde una alteración en la intensidad de fluorescencia determinada en la etapa (ii) con respecto a la intensidad de fluorescencia emitida en ausencia de dicho compuesto candidato es indicativo de que dicho compuesto es capaz de modular la concentración de Ca2+.

38. Método la reivindicación 36 en donde la proteína de fusión se localiza en un compartimento intracelular u orgánulo específico.

39. Método según la reivindicación 37 en donde dicho compartimento intracelular u orgánulo específico se selecciona del grupo formado por retículo endoplásmico o sarcoplásmico, núcleo, aparato de Golgi y mitocondria.

40. Método para la detección de Ca2+ en un animal que comprende

(i) proporcionar un animal no humano transgénico no humano transgénico que comprende un polinucleótido que permite la expresión en dicho animal de una proteína de fusión según la reivindicación 1,

y

(ii) determinar de forma no invasiva la emisión fluorescente en dicho animal.

41. Método la reivindicación 39 en donde la proteína de fusión se localiza en un compartimento intracelular u orgánulo específico.

42. Método según la reivindicación 40 en donde dicho compartimento intracelular u orgánulo específico se selecciona del grupo formado por retículo endoplásmico o sarcoplásmico, núcleo, aparato de Golgi y mitocondria.

43. Método de identificación de un compuesto con capacidad de modulación de la concentración de Ca2+ en un animal no humano transgénico que comprende

(i) poner en contacto un compuesto candidato con un animal no humano transgénico que comprende in polinucleótido que permite la expresión en dicho animal de una proteína de fusión según la reivindicación 1,

(ii) determinar de forma no invasiva la fluorescencia emitida por el animal transgénico en respuesta a una excitación a una longitud de onda correspondiente a la longitud de onda de excitación del segundo dominio polipeptídico fluorescente de dicha proteína de fusión,

en donde una alteración en la intensidad de fluorescencia determinada en la etapa (ii) con respecto a la intensidad de fluorescencia emitida en ausencia de dicho compuesto candidato es indicativo de que dicho compuesto es capaz de modular la concentración de Ca2+.

44. Método la reivindicación 42 en donde la proteína de fusión se localiza en un compartimento intracelular u orgánulo específico.

45. Método según la reivindicación 43 en donde dicho compartimento intracelular u orgánulo específico se selecciona del grupo formado por retículo endoplásmico o sarcoplásmico, núcleo, aparato de Golgi y mitocondria.

46. Método según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 44, en donde el primer dominio polipeptídico con capacidad de unir Ca2+ de dicha proteína de fusión es apoacuorina (SEQ ID NO: 2) o una variante funcionalmente activa de la misma.

47. Método según la reivindicación 45 en donde la variante funcionalmente equivalente de la apoacuorina muestra una afinidad por Ca2+ reducida con respecto a la apoacuorina.

48. Método según la reivindicación 46 en donde la variante de apoacuorina que muestra una afinidad para Ca2+ reducida con respecto a la apoacuorina tiene al menos una mutación seleccionada del grupo de D117A, D119A y D163A.

49. Método según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 47 en donde el péptido enlazador es un péptido con secuencia SEQ ID NO: 3, o variantes o fragmentos del mismo.

50. Método según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 48, en donde la longitud de onda de excitación se encuentra en un rango de entre aproximadamente 373 nm y aproximadamente 433 nm o en un rango de entre aproximadamente 440 nm y aproximadamente 500 nm.

51. Método según la reivindicación 49 en donde la longitud de onda de excitación se selecciona del grupo de 403 y 470 nm.

52. Método según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 50 en donde la longitud de onda de emisión se encuentra en un rango de entre aproximadamente 480 nm y aproximadamente 540 nm.

53. Método según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 51, que comprende además

(i) determinar la fluorescencia a una segunda longitud de onda correspondiente a una segunda longitud de onda de excitación del segundo dominio polipeptídico fluorescente de dicha proteína de fusión, y que es diferente de la primera longitud de onda de excitación del mismo y

(ii) comparar la señal con una señal de referencia, en donde una intensidad de la señal emitida alterada con respecto a una señal de referencia es indicativo de la presencia de Ca2+ en dicha célula o población celular.

54. Método según la reivindicación 52, en donde se determina la relación de la intensidad de la señal emitida en respuesta a excitación a la primera y la segunda longitudes de onda correspondientes a la primera y la segunda longitudes de onda de excitación del al menos un segundo dominio polipeptídico fluorescente.

55. Método según cualquiera la reivindicación 52 o 53, en donde la primera longitud de onda de excitación se encuentra en un rango de entre aproximadamente 373 nm y aproximadamente 433 nm y la segunda longitud de onda de excitación se encuentra en un rango de entre aproximadamente 440 nm y aproximadamente 500 nm, o en donde la primera longitud de onda de excitación se encuentra en el rango entre aproximadamente 440 nm y 500 aproximadamente nm y la segunda longitud de onda de excitación se encuentra en el rango entre aproximadamente 373 nm y aproximadamente 433 nm.

56. Método según la reivindicación 54, en donde la primera longitud de onda de excitación es aproximadamente de 403 nm y la segunda longitud de onda de excitación es aproximadamente de 470 nm, o en donde la primera longitud de onda de excitación es aproximadamente de 470 nm y la segunda longitud de onda de excitación es aproximadamente de 403 nm.

57. Método según cualquiera de las reivindicaciones 52 a 55, en donde la longitud de onda de emisión se encuentra en un rango de entre aproximadamente 480 nm y aproximadamente 540 nm.

58. Método según la reivindicación 56, en donde la longitud de onda de emisión es aproximadamente de 510 nm.

2+2+

Fig. 1

Fig. 2

Fig. 3

Fig. 4

Fig. 5

Fig. 6

LISTA DE SECUENCIAS

<110> UNIVERSIDAD DE VALLADOLID

<120> SENSORES DE CALCIO Y MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE CALCIO LIBRE INTRACELULAR

<130> P7826ES00

<160> 65

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 238

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína verde fluorescente (GFP) de Aequorea victoria que presenta las mutaciones F99S, M153T y V163A

<400> 1 Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 1 5 10 15 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys 35 40 45 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe 50 55 60

Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln 65 70 75 80

His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg

90 95 Thr Ile Phe Ser Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 115 120 125 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 130 135 140

Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly

145 150 155 160

Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val

165 170 175 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190

Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser 195 200 205

Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 210 215 220

Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235

<210> 2

<211> 189

<212> PRT

<213> Aequorea victoria <400> 2 Gly Lys Leu Thr Ser Asp Phe Asp Asn Pro Arg Trp Ile Gly Arg His 1 5 10 15 Lys His Met Phe Asn Phe Leu Asp Val Asn His Asn Gly Lys Ile Ser

Leu Asp Glu Met Val Tyr Lys Ala Ser Asp Ile Val Ile Asn Asn Leu 35 40 45 Gly Ala Thr Pro Glu Gln Ala Lys Arg His Lys Asp Ala Val Glu Ala 50 55 60

Phe Phe Gly Gly Ala Gly Met Lys Tyr Gly Val Glu Thr Asp Trp Pro 65 70 75 80

Ala Tyr Ile Glu Gly Trp Lys Lys Leu Ala Thr Asp Glu Leu Glu Lys 85 90 95 Tyr Ala Lys Asn Glu Pro Thr Leu Ile Arg Ile Trp Gly Asp Ala Leu 100 105 110 Phe Asp Ile Val Asp Lys Asp Gln Asn Gly Ala Ile Thr Leu Asp Glu 115 120 125 Trp Lys Ala Tyr Thr Lys Ala Ala Gly Ile Ile Gln Ser Ser Glu Asp

130 135 140

Cys Glu Glu Thr Phe Arg Val Cys Asp Ile Asp Glu Ser Gly Gln Leu 145 150 155 160

Asp Val Asp Glu Met Thr Arg Gln His Leu Gly Phe Trp Tyr Thr Met

165 170 175 Asp Pro Ala Cys Glu Lys Leu Tyr Gly Gly Ala Val Pro 180 185

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido enlazante <400> 3 Thr Ala Thr Pro Ala Thr Thr Pro Thr Thr Ala Pro Thr Ala Gly Thr 1 5 10 15

<210> 4

<211> 189

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de apoacuorina que contiene las mutaciones D117A, D119A y D163A

<400> 4 Gly Lys Leu Thr Ser Asp Phe Asp Asn Pro Arg Trp Ile Gly Arg His 1 5 10 15 Lys His Met Phe Asn Phe Leu Asp Val Asn His Asn Gly Lys Ile Ser

Leu Asp Glu Met Val Tyr Lys Ala Ser Asp Ile Val Ile Asn Asn Leu 35 40 45 Gly Ala Thr Pro Glu Gln Ala Lys Arg His Lys Asp Ala Val Glu Ala 50 55 60

Phe Phe Gly Gly Ala Gly Met Lys Tyr Gly Val Glu Thr Asp Trp Pro 65 70 75 80

Ala Tyr Ile Glu Gly Trp Lys Lys Leu Ala Thr Asp Glu Leu Glu Lys 85 90 95 Tyr Ala Lys Asn Glu Pro Thr Leu Ile Arg Ile Trp Gly Asp Ala Leu 100 105 110 Phe Asp Ile Val Ala Lys Ala Gln Asn Gly Ala Ile Thr Leu Asp Glu 115 120 125 Trp Lys Ala Tyr Thr Lys Ala Ala Gly Ile Ile Gln Ser Ser Glu Asp

130 135 140

Cys Glu Glu Thr Phe Arg Val Cys Asp Ile Asp Glu Ser Gly Gln Leu 145 150 155 160

Asp Val Ala Glu Met Thr Arg Gln His Leu Gly Phe Trp Tyr Thr Met

165 170 175 Asp Pro Ala Cys Glu Lys Leu Tyr Gly Gly Ala Val Pro 180 185

<210> 5

<211> 18

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Péptido enlazador

<400> 5 Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido enlazador

<400> 6 Gly Ser Gly Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido enlazador

<400> 7 Glu Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr 1 5 10

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido enlazador

<400> 8 Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gln 1 5 10 15

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido enlazador <400> 9 Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp

5 10

<210> 10

<211> 14

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido enlazador

<400> 10 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly 1 5 10

<210> 11

<211> 18

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido enlazador

<400> 11 Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser 1 5 10 15 Leu Asp

<210> 12

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido enlazador

<400> 12 Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Glu Leu Ala Phe Arg Ser Leu Asp 1 5 10 15

<210> 13

<211> 32

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido enlazador

<400> 13 Thr Ala Thr Pro Ala Thr Thr Pro Thr Thr Ala Pro Thr Ala Gly Thr 1 5 10 15

Thr Ala Thr Pro Ala Thr Thr Pro Thr Thr Ala Pro Thr Ala Gly Thr 20 25 30

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Residuo.

5. 56 .

5. 59 de tetranectina <400> 14 Gly Thr Lys Val His Met Lys 1 5

<210> 15

<211> 111

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Aminoácidos 1992-2102 de la fibronectina humana <400> 15 Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly 1 5 10 15 Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr Val Gln Lys Thr Pro Phe Val

Thr His Pro Gly Tyr Asp Thr Gly Asn Gly Ile Gln Leu Pro Gly Thr 35 40 45 Ser Gly Gln Gln Pro Ser Val Gly Gln Gln Met Ile Phe Glu Glu His 50 55 60

Gly Phe Arg Arg Thr Thr Pro Pro Thr Thr Ala Thr Pro Ile Arg His 65 70 75 80

Arg Pro Arg Pro Tyr Pro Pro Asn Val Gly Glu Glu Ile Gln Ile Gly

90 95 His Ile Pro Arg Glu Asp Val Asp Tyr His Leu Tyr Pro His Gly 100 105 110

<210> 16

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Aminoácidos 2037-2049 de la fibronectina humana <400> 16 Pro Gly Thr Ser Gly Gln Gln Pro Ser Val Gly Gln Gln 1 5 10

<210> 17

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Aminoácidos 2038-2042 de la fibronectina humana <400> 17 Gly Thr Ser Gly Gln 1 5

<210> 18

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de 10 aminoácidos de la región de la bisagra superior de la IgG3 murina <400> 18 Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser 1 5 10

<210> 19

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido enlazador

<400> 19 Ala Pro Ala Glu Thr Lys Ala Glu Pro Met Thr 1 5 10

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido enlazador

<400> 20 Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gln 1 5

<210> 21

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido enlazador

<400> 21 Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser 1 5

<210> 22

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido de localización nuclear

<400> 22 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido de localización nuclear

<400> 23 Pro Gln Lys Lys Ile Lys Ser 1 5

<210> 24

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido de localización nuclear

<400> 24 Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5

<210> 25

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> <223> Péptido de localización nuclear

<400> 25 Gln Pro Lys Lys Pro 1 5

<210> 26

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido de localización nuclear

<400> 26 Arg Lys Lys Arg 1

<210> 27

<211> 12

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido de localización nuclear

<400> 27 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala His Gln 1 5 10

<210> 28

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido de localización nuclear

<400> 28 Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gln Arg 1 5 10 15

<210> 29

<211> 19

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido de localización nuclear

<400> 29 Met Pro Leu Thr Arg Arg Arg Pro Ala Ala Ser Gln Ala Leu Ala Pro 1 5 10 15

Pro Thr Pro

<210> 30

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido de localización nuclear

<400> 30 Gly Ala Ala Leu Thr Ile Leu Val 1 5

<210> 31

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido de localización nuclear

<400> 31 Gly Ala Ala Leu Thr Leu Leu Gly 1 5

<210> 32

<211> 201

<212> PRT

<213> Xenopus laevis <400> 32 Met Ala Ser Thr Val Ser Asn Thr Ser Lys Leu Glu Lys Pro Val Ser 1 5 10 15 Leu Ile Trp Gly Cys Glu Leu Asn Glu Gln Asn Lys Thr Phe Glu Phe Lys Val Glu Asp Asp Glu Glu Lys Cys Glu His Gln Leu Ala Leu Arg 35 40 45 Thr Val Cys Leu Gly Asp Lys Ala Lys Asp Glu Phe His Ile Val Glu 50 55 60

Ile Val Thr Gln Glu Glu Gly Ala Glu Lys Ser Val Pro Ile Ala Thr

70 75 80

Leu Lys Pro Ser Ile Leu Pro Met Ala Thr Met Val Gly Ile Glu Leu 85 90 95 Thr Pro Pro Val Thr Phe Arg Leu Lys Ala Gly Ser Gly Pro Leu Tyr 100 105 110 Ile Ser Gly Gln His Val Ala Met Glu Glu Asp Tyr Ser Trp Ala Glu 115 120 125 Glu Glu Asp Glu Gly Glu Ala Glu Gly Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 130 135 140 Glu Asp Gln Glu Ser Pro Pro Lys Ala Val Lys Arg Pro Ala Ala Thr 145 150 155 160 Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Leu Asp Lys Glu Asp Glu 165 170 175 Ser Ser Glu Glu Asp Ser Pro Thr Lys Lys Gly Lys Gly Ala Gly Arg 180 185 190 Gly Arg Lys Pro Ala Ala Lys Lys Val 195 200

<210> 33

<211> 81

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Residuos 1-81 de la galactosiltransferasa humana <400> 33 Met Arg Leu Arg Glu Pro Leu Leu Ser Gly Ser Ala Ala Met Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Leu Gln Arg Ala Cys Arg Leu Leu Val Ala Val Cys Ala Leu His Leu Gly Val Thr Leu Val Tyr Tyr Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ser 35 40 45 Arg Leu Pro Gln Leu Val Gly Val Ser Thr Pro Leu Gln Gly Gly Ser

55 60 Asn Ser Ala Ala Ala Ile Gly Gln Ser Ser Gly Glu Leu Arg Thr Gly 65 70 75 80 Gly

<210> 34

<211> 550

<212> PRT

<213> Photinus pyralis <400> 34 Met Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro 1 5 10 15 Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg

Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu 35 40 45 Val Asn Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala 50 55 60 Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile Val Val 65 70 75 80 Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu 85 90 95 Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg 100 105 110 Glu Leu Leu Asn Ser Met Asn Ile Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val 115 120 125 Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro 130 135 140 Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly 145 150 155 160 Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe 165 170 175 Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile 180 185 190 Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val 195 200 205 Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp

210 215 220 Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser Val 225 230 235 240 Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu 245 250 255 Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu 260 265 270 Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val 275 280 285 Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr

290 295 300 Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser 305 310 315 320 Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile 325 330 335 Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr 340 345 350 Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe 355 360 365 Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val

370 375 380 Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met Ser Gly 385 390 395 400 Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly

405 410 415 Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe 420 425 430 Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln 435 440 445 Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro Asn Ile 450 455 460 Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu 465 470 475 480 Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys 485 490 495 Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu 500 505 510 Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly 515 520 525 Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys 530 535 540 Gly Gly Lys Ser Lys Leu 545 550

<210> 35

<211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de localización en mitocondria <400> 35 Arg Arg Ile Val Val Leu His Gly Tyr Gly Ala Val Lys Glu Val Leu 1 5 10 15 Leu Asn His Lys <210> 36

<211> 22

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Aminoácido.

7. 95 del citocromo P450 2E1 de rata <400> 36 Ser Arg Arg Ile Val Val Leu His Gly Tyr Lys Ala Val Lys Glu Val 1 5 10 15 Leu Leu Asn His Lys Asn <210> 37

<211> 22

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia del precursor de citocromo c oxidasa IV de levadura <400> 37 Met Leu Ser Leu Arg Gln Asp Ile Arg Phe Phe Lys Pro Ala Thr Arg 1 5 10 15 Thr Leu Cys Ser Ser Arg

<210> 38

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 38 Lys Leu Leu Asn Leu Ile Ser Lys Leu Phe 1 5 10

<210> 39

<211> 32

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido de localización en mitocondria <220>

<221> característica_misc

<222> (7) .. (8)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221> característica_misc

<222> (32) .. (32)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<400> 39 Met Leu Phe Asn Leu Arg Xaa Xaa Leu Asn Asn Ala Ala Phe Arg His 1 5 10 15 Gly His Asn Phe Met Val Arg Asn Phe Arg Cys Gly Gln Pro Leu Xaa

<210> 40

<211> 29

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de direccionamiento a la ruta secretora <400> 40 Met Met Ser Phe Val Ser Leu Leu Leu Val Gly Ile Leu Phe Trp Ala 1 5 10 15 Thr Glu Ala Glu Gln Leu Thr Lys Cys Glu Val Phe Gln

<210> 41

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 41 Met Gly Thr Ala Arg Ile Ala Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Cys Cys 1 5 10 15 Pro Val Leu Ser Ser Ala Tyr Ala Leu

<210> 42

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 42 Met Ser Val Leu Thr Pro Leu Leu Leu Arg Gly Leu Thr Gly Ser Ala 1 5 10 15 Arg Arg Leu Pro Val Pro Arg Ala Lys

<210> 43

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 43 Met Val Leu Leu Leu Ile Leu Ser Val Leu Leu Leu Lys Glu Asp Val 1 5 10 15

Arg Gly Ser Ala 20

<210> 44

<211> 38

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 44 Met Ala Ser Pro Arg Ser Ser Gly Gln Pro Gly Pro Pro Pro Pro Pro 1 5 10 15 Pro Pro Pro Pro Ala Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu 20 25 30 Leu Pro Leu Ala Pro Gly 35

<210> 45

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 45 Met Leu Leu Ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu Ala Val 1 5 10 15 Ala <210> 46

<211> 2288

<212> DNA

<213> Homo sapiens <400> 46 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtaa ggggctcaca 60 gtagcaggct tgaggtctgg acatatatat gggtgacaat gacatccact ttgcctttct 120 ctccacaggt gtccactccc aggtccaact gcagcagcct ggggctgagc ttgtgaagcc 180 tggggcttca gtgaagctgt cctgcaaggc ttctggctac accttcacca gctactggat 240 gcactgggtg aagcagaggc ctggacgagg ccttgagtgg attggaagga ttgatcctaa 300 tagtggtggt actaagtaca atgagaagtt caagagcaag gccacactga ctgtagacaa 360 accctccagc acagcctaca tgcagctcag cagcctgaca tctgaggact ctgcggtcta 420 ttattgtgca agatacgatt actacggtag tagctacttt gactactggg gccaaggcac 480 cactctcaca gtctcctcag gtgagtcctt acaacctctc tcttctattc agcttaaata 540 gattttactg catttgttgg gggggaaatg tgtgtatctg aatttcaggt catgaaggac 600 tagggacacc ttgggagtca gaaagggtca ttgggagccc tggctgatgc agacagacat 660 cctcagctcc cagacttcat ggccagagat ttatagggat ctctagaaga atgcagcata 720 cactcctatt tcaaggggta ctggcaagag aaaaggactt tccttgggac tggccacatt 780 aacactatta gggaggacac agaacagtgt aaagaatgag gaaggggaag gaaggtggct 840 gagtttaaca ggttctcatc aagaggtctg agctgtgtag aacaagtaac agatagtagc 900 cagctacatc aagagagaaa ggctgcccac acagggaaag catagggtag gaggttgttg 960 gttatcctca gaaagcaggg accaaggtcc aaggagagct aaacccatgg atagagacct 1020 agaaccaaga tttaggagcc agagcttgaa taagcatagt agactaaaaa ggggcttctg 1080 aaaggcatca tcactaaagg atcagggttc atgggactag agagatggct gagtggtgaa 1140 aaggaatagc tactctttca gaggacccag gttcagctaa caacaaccag atggcatctt 1200 acaatggact gtaagaaaca ccagtttctg ggtattcacc gctcctttct accagcacag 1260 ccatcgggca cacacataat acacaaattc acacatcgaa aataaaaaac atggaaaaat 1320 taaggtcaca gtgcaagctc tggaggtgga aatttctgac actgcttgcc tcagatcaat 1380 tgtagaagac acggttctaa gagcaaagct aagaacagaa tctctccaaa tatccgaggc 1440 cactgataag aaaaagctca cacattctcc tctcttgcag ccaaaacaac acccccatca 1500 gtctatccac tggcccctgg gtgtggagat acaactggtt cctccgtgac tctgggatgc 1560 ctggtcaagg gctacttccc tgagtcagtg actgtgactt ggaactctgg atccctgtcc 1620 agcagtgtgc acaccttccc agctctcctg cagtctggac tctacactat gagcagctca 1680 gtgactgtcc cctccagcac ctggccaagt cagaccgtca cctgcagcgt tgctcaccca 1740 gccagcagca ccacggtgga caaaaaactt ggtgagagga cattcagggg aggagggatt 1800 caccagagtt gaggcaaagg tattagccta tctaaaccag ccaggctggg atccatcacc 1860 aaggaggtga ccttagccca gggaagaggg agatactgtc tctgcctccc tcctgggaac 1920 atctagctat gaccacctac actcaaggac atgatcctct gggataggtg tgcttgtcat 1980 ttccaggatc atcctggact aagcccatac cagggacaaa ctttcctctc tctggtttgg 2040 tgcttctctc cttcaaaaac cagtaacatc cagccttctc tctgcagagc ccagcgggcc 2100 catttcaaca atcaacccct gtcctccatg caaggagtgt cacaaatgcc caggtaagtc 2160 actaccagag ctccactccc aggagaatgg taagtgctgt aaaaatccct gtaatggagg 2220 ataagccatg tacaaatcca tttccatctc tcctcatcag ctcctaacct cgacggtatc 2280 gataagct 2288

<210> 47

<211> 31

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 47 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Lys Gly Leu Thr Val Ala Gly Leu Arg Ser Gly His Ile Tyr Gly 20 25 30

<210> 48

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> <223> Péptido de retención en el retículo endoplásmico <400> 48 Lys Asp Glu Leu 1

<210> 49

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido de retención en el retículo endoplásmico <400> 49 Asp Asp Glu Leu 1

<210> 50

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido de retención en el retículo endoplásmico <400> 50 Asp Glu Glu Leu 1

<210> 51

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido de retención en el retículo endoplásmico <400> 51 Gln Glu Asp Leu 1

<210> 52

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido de retención en el retículo endoplásmico <400> 52 Arg Asp Glu Leu 1

<210> 53

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido de retención en el retículo endoplásmico <400> 53 Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn 1 5

<210> 54

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Residuo.

4. 57 de la proteína TAT de HIV

<400> 54 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg 1 5

<210> 55

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Variante sintética del péptido de residuo.

4. 57 de la proteína TAT de HIV

<400> 55 Tyr Ala Arg Lys Ala Arg Arg Gln Ala Arg Arg 1 5 10

<210> 56

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Variante sintética del péptido de residuo.

4. 57 de la proteína TAT de HIV

<400> 56 Tyr Ala Arg Ala Ala Arg Arg Ala Ala Arg Arg 1 5 10

<210> 57

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Variante sintética del péptido de residuo.

4. 57 de la proteína TAT de HIV

<400> 57 Tyr Ala Arg Ala Ala Arg Arg Ala Ala Arg Ala 1 5 10

<210> 58

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Variante sintética del péptido de residuo.

4. 57 de la proteína TAT de HIV

<400> 58 Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala 1 5 10

<210> 59

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia derivada de la tercera hélice del homeodominio de la proteína Antennapedia <400> 59 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15

<210> 60

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sentido para la amplificación de apoacuorina <400> 60 ttggtaccgg taaacttaca tcagacttc 29

<210> 61

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleótido antisentido para la amplificación de apoacuorina <400> 61 ccgaattctt aggggacagc tccaccg 27

<210> 62

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sentido para la amplificación de GFPuv

<400> 62 ccaaagcttg ccaccatggc tagcaaagga 30

<210> 63

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido antisentido para la amplificación de GFPuv

<400> 63 ttggtacccg gtttgtagag ctcat 25

<210> 64

<211> 45

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido de hibridación <400> 64 agcgacccca gcaaccacgc cgaccactgc accgaccgcg ggtac 45

<210> 65

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<212> ADN

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