Reguladores de la MMP-9 y usos de los mismos.

Un procedimiento de identificación de un agente para el tratamiento del cáncer y afecciones inflamatorias,

comprendiendo el procedimiento determinar si el agente puede interaccionar con el dominio O-glucosilado (OG) dela MMP-9, siendo dicho agente un supuesto regulador negativo de la actividad colagenolítica de la MMP-9 y ensayardicho agente para determinar la capacidad de regular negativamente la actividad colagenolítica de la MMP-9.

Reguladores de la MMP-9 y usos de los mismos Campo y antecedentes de la invención La presente invención se refiere a reguladores de la MMP-9 y, más particularmente, a reguladores dirigidos hacia el dominio OG de la misma.

Las funciones fisiológicas y patológicas de las metaloproteinasas de la matriz (MMP) son versátiles. En numerosos aspectos de la migración de células inflamatorias y cancerosas, a través de tejidos conectivos, no solamente catabolizando los componentes de la matriz extracelular (ECM) sino también procesando diversos mediadores solubles, promoviendo muchas patologías, se han implicado miembros de la familia de las MMP. Aunque todas las MMP comparten sitios catalíticos similares, se observan notables diferencias en cuanto a su especificidad de sustrato, debido, al menos en parte, a la presencia de sitios de unión a sustrato adicionales en dominios proteicos no catalíticos. Como una consecuencia, diferentes MMP tienen diferentes funciones biológicas. La MMP-9, también conocida como gelatinasa B, es una diana prototípica en enfermedades inflamatorias, debido a sus funciones en lesiones tisulares y procesamiento de proteínas solubles que promueven la inflamación, incluyendo inhibidores de proteasa, quimiocinas y citocinas.

En cambio, la MMP-2 o gelatinasa A, tiene funciones principalmente antiinflamatorias u homeostáticas, presumiblemente por la inactivación de quimiocinas inflamatorias y por la regulación de la renovación de tejido conectivo. Esto implica que los inhibidores selectivos, que discriminan entre estas enzimas muy similares, son cruciales para la terapia antiinflamatoria eficaz sin efectos secundarios. En esta perspectiva, otras partes no catalíticas de la enzima, diferenciando la MMP-2 y la MMP-9, pueden dirigirse para generar inhibidores selectivos.

Curiosamente, la principal diferencia estructural entre la MMP-9 y la MMP-2 es la presencia de un dominio ampliamente O-glucosilado (OG) en la MMP-9 [Opdenakker, G., y col (2001) , Trends Immunol. 22, 571-579; Van den Steen, P. E., y col (2006) J Biol Chem. 281, 18626-18637]. Otros dominios en la MMP-9 también se encuentran en la MMP-2 e incluyen un dominio propéptido responsable de mantener la latencia, un dominio catalítico en el que se insertan tres repeticiones de fibronectina, y un dominio C-terminal también conocido como dominio similar a hemopexina que constituye un exositio para la unión del inhibidor endógeno de MMP-9 y MMP-2, inhibidor tisular de metaloproteinasa 1 (TIMP-1) . A pesar de su gran importancia en muchas patologías y a diferencia de la MMP-2, la información estructural disponible sobre la MMP-9 está limitada a sus dos dominios terminales, en lugar de a la enzima de longitud completa. La estructura de rayos X de la parte N terminal [Elkins y col, 2002, Acta Cr y stallogr D Biol Cr y stallogr 58, 1182-1192], que contiene el dominio pro-catalítico muestra que posee un plegamiento de matrixina. El dominio C terminal similar a la hemopexina consiste en una estructura en hélice con cuatro álabes ? con simetría seudo-cuadri-plegada [Cha y col, 2002, J Mol Biol 320, 1065-1079]. La Figura 1A presenta las estructuras cristalinas de los dominios pro-catalítico y similar a la hemopexina de la pro-MMP-9. Los dominios están conectados por una línea de puntos que representa el engarce de 64 aminoácidos de longitud (que contiene 22 restos de prolina, 6 restos de glicina y aproximadamente 12-14 glucanos O unidos [Van den Steen y col., 2001, Biochim Biophys Acta 1528, 61-73]. Cabe destacar que, el dominio engarzador de la pro-MMP-9 es 2-3 veces mas largo que las regiones engarzadoras de las colagenasas, estromelisinas y gelatinasa A, de la familia de las MMP, para la cual las longitudes típicas de los engarces abarcan un intervalo de solo 21-27 restos de aminoácidos.

Se ha demostrado que la cristalización del dominio engarzador en la pro-MMP-9, individualmente o junto con otros dominios de proteínas, es difícil. La ausencia de una cadena lateral larga, en el caso de la glicina, y la presencia de un pliegue integrado, en el caso de la prolina, interfiere con la formación de estructuras secundarias y, a menudo, da como resultado regiones en bucle o no estructuradas. Además, la presencia de serinas y treoninas agrupadas como puntos de conexión para O-glucanos produciría efectos estéricos que podrían impedir el empaquetamiento cristalográfico. Este domino también se ha denominado dominio similar al colágeno V, debido a la similitud de su secuencia con la del colágeno V y recientemente se ha renombrado dominio O-glucosilado (OG) . El domino OG es activo en la orientación de los dominios de la hemopexina para permitir interacciones exositio. Sin embargo, no se sabe nada acerca de la influencia del dominio OG sobre la estructura 3D global de la MMP-9 y su naturaleza biofísica.

La Patente de Estados Unidos Nº 20040175817 explica la identificación de moduladores de MMP-9 basados en la estructura cristalina de su subunidad catalítica. Sin embargo, dado que, en general, las MMP comparten una alta homología de secuencia en sus sitios catalíticos, los moduladores diseñados para dirigirse al sitio catalítico no serán selectivos hacia la MMP-9.

Sumario de la invención Existe una necesidad de reguladores específicos de la MMP-9.

De acuerdo con un aspecto, se proporciona un procedimiento de identificación de un agente que sea capaz de regular específicamente la MMP-9, comprendiendo el procedimiento determinar si el agente es capaz de interaccionar con el dominio OG de la MMP-9, siendo el agente un supuesto regulador negativo de la actividad

colagenolítica de la MMP-9, y sometiendo a ensayo dicho agente con respecto a la capacidad para regular negativamente la actividad colagenolítica de la MMP-9.

De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un anticuerpo que interacciona específicamente con un domino OG de la MMP-9 para regular negativamente la actividad colagenolítica de la MMP-9 para su uso en el tratamiento del cáncer y trastornos inflamatorios.

De acuerdo con un aspecto adicional, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

De acuerdo con otro aspecto adicional, se proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo.

De acuerdo con una realización, la MMP-9 es la MMP-9 natural.

De acuerdo con otra realización más, el agente comprende un agente polipeptídico.

De acuerdo con otra realización más, el agente polipeptídico comprende un anticuerpo.

De acuerdo con otra realización más, el agente comprende una molécula pequeña.

De acuerdo con otra realización más, la determinación se efectúa comparando una estructura del agente con una estructura de un dominio OG de la MMP-9.

De acuerdo con otra realización más, la determinación se efectúa poniendo en contacto dicho agente con un domino OG aislado de la MMP-9.

De acuerdo con otra realización más, el agente comprende un polipéptido.

De acuerdo con otra realización más, el polipéptido comprende un anticuerpo.

De acuerdo con otra realización más, el agente comprende una molécula pequeña.

De acuerdo con otra realización más, el agente se identifica como se describe en el presente documento.

De acuerdo con otra realización más, el agente comprende una molécula pequeña o un agente polipeptídico.

De acuerdo con otra realización más, el agente polipeptídico comprende un anticuerpo.

De acuerdo con otra realización más, la molécula comprende un anticuerpo humanizado que comprende un dominio de reconocimiento de antígenos que interacciona específicamente con el dominio OG de la MMP-9.

Breve descripción de los dibujos En el presente documento la invención se describe únicamente como ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia específica ahora a los dibujos con detalle, se resalta que las particularidades mostradas se ofrecen solo como ejemplo y con objeto de analizar de un modo ilustrativo las realizaciones preferidas de la presente invención, y se presentan para ofrecer lo que se piensa que es la descripción más útil y fácilmente comprensible de los principios y aspectos conceptuales de la presente invención. En este sentido, para una comprensión fundamental de la invención no se intentan mostrar detalles estructurales de la misma más detalladamente de lo necesario siendo obvia la descripción, junto con los dibujos, para los expertos en la técnica, de como pueden llevarse a la práctica las diferentes formas de la invención.

En los dibujos:

Las FIGs. 1A-D son modelos y gráficos generados por ordenador que caracterizan la pro-MMP-9. La Figura 1A ilustra las estructuras cristalinas de los dominios terminales. El dominio N terminal... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de identificación de un agente para el tratamiento del cáncer y afecciones inflamatorias, comprendiendo el procedimiento determinar si el agente puede interaccionar con el dominio O-glucosilado (OG) de la MMP-9, siendo dicho agente un supuesto regulador negativo de la actividad colagenolítica de la MMP-9 y ensayar

dicho agente para determinar la capacidad de regular negativamente la actividad colagenolítica de la MMP-9.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha determinación se efectúa comparando una estructura del agente con una estructura del dominio OG de la MMP-9.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha determinación se efectúa poniendo en contacto dicho agente con un dominio OG aislado de la MMP-9.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho agente comprende un anticuerpo.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho agente comprende una molécula pequeña.

6. Un anticuerpo que interacciona específicamente con el dominio OG de la MMP-9 para regular negativamente la actividad colagenolítica de dicha MMP-9 para su uso en el tratamiento del cáncer y de trastornos inflamatorios.

7. El anticuerpo de la reivindicación 6, que es un anticuerpo humanizado.

8. El anticuerpo de la reivindicación 7, que se formula en una composición farmacéutica.