Procedimiento para producir derivado de asparagina de la cadena de azúcar.

Un procedimiento para preparar un derivado de asparagina de la cadena de azúcar derivado de unaasparagina de la cadena de azúcar,

que comprende las etapas de

(a) introducir un grupo protector soluble en grasa seleccionado de grupo Fmoc, grupo t-butiloxicarbonilo (Boc),grupo bencilo, grupo alilo, grupo aliloxicarbonato y grupo acetilo en la asparagina de la cadena de azúcar contenida enuna mezcla de una o más asparaginas de la cadena de azúcar, dando una mezcla de derivados de asparagina de lacadena de azúcar, en el que la mezcla de una o más asparaginas de la cadena de azúcar comprende:**Fórmula*+

y/o un compuesto que tiene una o más deleciones de residuos de azúcar en el compuesto anterior; y

(b) someter la mezcla de derivados de asparagina de la cadena de azúcar o una mezcla obtenible hidrolizandoun derivado de asparagina de la cadena de azúcar contenida en la mezcla de derivados de asparagina de la cadena deazúcar a cromatografía, para separar cada uno de los derivados de asparagina de la cadena de azúcar de los mismos.

Procedimiento para producir derivado de asparagina de la cadena de azúcar

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar un derivado de asparagina de la cadena de azúcar.

TÉCNICA ANTERIOR

Convencionalmente, una técnica para degradar una cadena de azúcar por una glucosidasa para derivatizar lacadena de azúcar se ha utilizado en los estudios analíticos a una escala de varios miligramos tal como análisis estructural de una cadena de azúcar. Sin embargo, como los derivados de cadenas de azúcar individuales no podíanobtenerse en una gran cantidad, se ha retrasado el desarrollo de los estudios a una escala de gramos. Por tanto, ha sido difícil aplicar un derivado de la cadena de azúcar a los estudios de síntesis tales como la fabricación de productosfarmacéuticos.

Por otra parte, se sabe que un glucopéptido se obtiene en una gran cantidad a partir de una yema de huevo (Biochimica et Biophysica Acta 1335 (1997) p23-32) . Sin embargo, no se ha informado de un caso en el que un derivado de la cadena de (Fmoc-) azúcar fluorenilmetoxicarbonilado de un compuesto 1 mostrado en la Figura 1, o una serie decompuestos que tienen deleciones de varios residuos de azúcar tales como ácido siálico o galactosa sobre uno de losextremos no reductores de una cadena de azúcar ramificada en el compuesto 1, se obtienen en una gran cantidad.Además, hay algunos casos en los que varias cadenas de azúcar se aíslan en una pequeña cantidad de una proteína osimilares en sangre humana. Sin embargo, cuando la cadena de azúcar se emplea en la fabricación de un producto farmacéutico, hay un riesgo de permitir que el producto farmacéutico se contamine por el virus del SIDA, virus de lahepatitis o similares. Por tanto, ha habido una controversia sobre la técnica de aplicar la cadena de azúcar a unproducto farmacéutico.

Mientras tanto, hay numerosos ejemplos de procedimientos para preparar cadenas de azúcar de las que restosramificados tienen la misma estructura para una cadena de azúcar ramificada. Como técnicas convencionales hay tres tipos de procedimientos. Un primer es un procedimiento para aislar y purificar un complejo de cadena de azúcar tipoasparagina de una glucoproteína que se produce naturalmente. Ejemplos representativos de este tipo son aquellos informados en T. Tamura y col., Anal. Biochem., 1994, 216, p335-344, V. H. Thomas y col., Carbohydr. Res., 1998, 306, p387-400, K. G. Rice y col., Biochemistr y , 1993, 32, p7264-7270 y similares. La ventaja de estos procedimientos es quela síntesis de la cadena de azúcar no es necesaria. Sin embargo, hay varios defectos. Por ejemplo, la cadena de azúcarderivada de la glucoproteína anterior se obtiene como una mezcla de las cadenas de azúcar que tienen deleciones alazar de varios residuos de azúcar en restos terminales no reductores, y las cadenas de azúcar contenidas en la mezclaanterior son similares entre sí en sus características físicas y químicas, de manera que es muy difícil separarlas en cadenas de azúcar individuales, haciendo así que sea sustancialmente imposible obtener una única cadena de azúcar en una gran cantidad. Por tanto, hay un caso en el que una cadena de azúcar ha sido aislada de una proteína en sangre humana (aislamiento de fibrinógeno: C. H. Hokke y col., Carbohydr. Res., 305 (1997) , p463-468, aislamiento de transferrina de suero humano: M. Mizuno y col., J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, p284-290) con el fin de obtener la cadena de azúcar en una cantidad relativamente grande. Como se ha mencionado anteriormente, una proteína en sangre humana debe manipularse cuidadosamente debido a que la proteína puede contaminarse con un virus del SIDA

o virus de la hepatitis. Por tanto, es difícil utilizar las cadenas de azúcar resultantes y derivados de las mismas en eldesarrollo de productos farmacéuticos. Incluso si las cadenas de azúcar se obtuvieran en una gran cantidad, sus estructuras estarían limitadas, y sustancialmente no existen muchos casos en los que se obtenga cadenas de azúcar y derivados de las mismas que tengan muchos tipos de estructuras.

En K. G. Rice y col., Biochemistr y , 1993, 32, p7264-7270, o Rice y col., Neoglycoconjugate, Academic Press, 1994, ISBN 85-1 p286-321, un residuo de azúcar se elimina de un extremo no reductor de una cadena deazúcar con una glucosidasa. Sin embargo, como una cadena de azúcar que tiene una única estructura usada comomaterial de partida no puede obtenerse en una gran cantidad, el procedimiento sólo puede llevarse a cabo a una escalaanalítica. E. Meinjohanns (J. Chem. Soc. Perkin Trans 1, 1998, p549-560) y col. han obtenido un compuesto 56 mostrado en la Figura 5 de una fetuína bovina (glucoproteína derivada de bovino) y luego sintetizado un compuesto 10mostrado en la Figura 1 mediante un compuesto 33 mostrado en la Figura 3. Con el fin de obtener el compuesto 56, quees un primer material de partida, se ha utilizado una reacción de degradación de hidracina. Esta hidracina es altamente tóxica, de manera que hay un problema en la seguridad cuando el derivado de la cadena de azúcar resultante se aplicaa un producto farmacéutico debido a la contaminación de una cantidad traza de la hidracina. Además, los derivados dela cadena de azúcar de los compuestos 56, 33 y 10 a los que el ácido siálico no está unido pueden obtenerse sólo enuna pequeña cantidad.

Un segundo procedimiento es un procedimiento de síntesis de una cadena de azúcar químicamente.Actualmente, una construcción de aproximadamente 10 azúcares preparada combinando monosacáridos según un procedimiento de síntesis química puede prepararse como se muestra en un caso informado de J. Seifert y col., Angew Chem Int. Ed. 2000, 39, p531-534. La ventaja de este procedimiento es que todos los derivados de la cadena de azúcar pueden obtenerse teóricamente. Sin embargo, como sus etapas de preparación son enormes, hay un defecto de queuna síntesis en una gran cantidad es difícil. Además, incluso en el caso en el que una cadena de azúcar en la queaproximadamente 10 residuos de azúcar están unidos se sintetice en una cantidad de varios miligramos, se requiere unperiodo de tiempo tan largo como de aproximadamente un año. Aunque hasta la fecha se han observado algunos casosen los que varias cadenas de azúcar se sintetizan químicamente, la mayoría de los casos podrían sintetizar en realidadla cadena de azúcar prevista sólo en una cantidad de tan solo varios miligramos.

Un tercer procedimiento es un procedimiento de síntesis de una cadena de azúcar combinando una reacciónenzimática y una reacción química. Como ejemplo representativo hay un procedimiento como se informa por Carlo Unverzagt, Angew Chem Int. Ed. 1996, 35, p2350-2353. Este procedimiento emplea una técnica en la que una cadenade azúcar se construye a una cierta longitud por síntesis química, y después un residuo de azúcar se añade a la cadenade azúcar por una reacción enzimática, extendiéndose así la cadena de azúcar. Sin embargo, como la enzima usada enla extensión de cadena tiene especificidad por sustrato, los tipos de azúcar que pueden introducirse en la cadena de5 azúcar están limitados. Además, como las etapas de preparación son enormes en la síntesis química, es difícil una síntesis a escala industrial, de manera que el producto final puede obtenerse sólo en una pequeña cantidad. Alternativamente, en C. H. Lin y col. (Bioorganic & Medicinal Chemistr y , 1995, p1625-1630) , un sialiloligoglucopéptido seobtiene a partir de una yema de huevo empleando un procedimiento informado por M. Koketsu y col. (J. Carbohydrate Chemistr y , 1995, 14 (6) , p833-841) , y la estructura de los restos terminales no reductores de la cadena de azúcar se10 modifica con una glucosidasa y una azúcar transferasa. Una cadena de azúcar que tiene sólo un residuo de asparagina (Asn) unido a su resto terminal no reductor se muestra en un dibujo de este artículo. Sin embargo, según el procedimiento informado en J. Carbohydrate Chemistr y , 1995, 14 (6) , p833-841, una mezcla de cadenas de azúcar que tiene cada una en promedio aproximadamente 2, 5 aminoácidos distintos de asparagina, tales como lisina, que están unidos a un extremo no reductor de la cadena de azúcar. Por tanto, un derivado de la cadena de azúcar no puede15 obtenerse como un único compuesto. Por tanto, no hay obtención sugerida de derivados individuales de los compuestos que tienen deleciones arbitrarias de los residuos de azúcar en la cadena de azúcar ramificada de las cadenas de azúcaren ramificación en una gran cantidad. Un artículo por C. H. Lin y col. no da ninguna prueba de que una cadena deazúcar se obtenga como un único producto. Y. Ichikawa menciona en Glycopeptide and Related Compounds (Marcel Dekker, Inc., 1997, ISBN... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para preparar un derivado de asparagina de la cadena de azúcar derivado de una asparagina de la cadena de azúcar, que comprende las etapas de (a) introducir un grupo protector soluble en grasa seleccionado de grupo Fmoc, grupo t-butiloxicarbonilo (Boc) , grupo bencilo, grupo alilo, grupo aliloxicarbonato y grupo acetilo en la asparagina de la cadena de azúcar contenida en una mezcla de una o más asparaginas de la cadena de azúcar, dando una mezcla de derivados de asparagina de lacadena de azúcar, en el que la mezcla de una o más asparaginas de la cadena de azúcar comprende:

y/o un compuesto que tiene una o más deleciones de residuos de azúcar en el compuesto anterior; y

(b) someter la mezcla de derivados de asparagina de la cadena de azúcar o una mezcla obtenible hidrolizando un derivado de asparagina de la cadena de azúcar contenida en la mezcla de derivados de asparagina de la cadena de azúcar a cromatografía, para separar cada uno de los derivados de asparagina de la cadena de azúcar de los mismos.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de (b') hidrolizar el derivado deasparagina de la cadena de azúcar separado en la etapa (b) con una glucosidasa.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el grupo protector soluble en grasa es un grupo fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) .

4. El procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la etapa (a) es una etapa de introducirFmoc en la asparagina de la cadena de azúcar contenida en una mezcla de una o más asparaginas de la cadena deazúcar que tiene un residuo de ácido siálico en un extremo no reductor, e introducir un grupo bencilo en el residuo de

ácido siálico, dando una mezcla de derivados de asparagina de la cadena de azúcar.

5. El procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de (c) eliminar el grupo protector del derivado de asparagina de la cadena de azúcar separado en la etapa (b) dando la asparagina de la cadena de azúcar.

6. El procedimiento según la reivindicación 5, que comprende además la etapa de (b') hidrolizar el derivado de asparagina de la cadena de azúcar separado en la etapa (b) con una glucosidasa; y/o (c') hidrolizar la asparagina de la cadena de azúcar obtenida en la etapa (c) con una glucosidasa.

7. El procedimiento según la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en el que el grupo protector soluble en grasa es Fmoc.

8. El procedimiento según la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en el que la etapa (a) es una etapa de introducir Fmoc en la asparagina de la cadena de azúcar contenida en una mezcla de una o más asparaginas de la cadena deazúcar que tiene un residuo de ácido siálico en un extremo no reductor, e introducir un grupo bencilo en el residuo deácido siálico, dando una mezcla de derivados de asparagina de la cadena de azúcar.

9. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además las etapas de

(c) eliminar el grupo protector del derivado de asparagina de la cadena de azúcar separado en la etapa (b) , dando una asparagina de la cadena de azúcar; y

(d) eliminar un residuo de asparagina de la asparagina de la cadena de azúcar obtenida en la etapa (c) , dando la cadena de azúcar.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, que comprende además la (s) etapa (s) de:

(b') hidrolizar el derivado de asparagina de la cadena de azúcar separado en la etapa (b) con una glucosidasa; y/o (c') hidrolizar la asparagina de la cadena de azúcar obtenida en la etapa (c) con una glucosidasa; y/o (d') hidrolizar la cadena de azúcar obtenida en la etapa (d) con una glucosidasa.

11. El procedimiento según la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en el que el grupo protector soluble en grasa es Fmoc.

12. El procedimiento según la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en el que la etapa (a) es una etapa deintroducir Fmoc en la asparagina de la cadena de azúcar contenida en una mezcla de una o más asparaginas de lacadena de azúcar que tiene un residuo de ácido siálico en un extremo no reductor, e introducir un grupo bencilo en el

residuo de ácido siálico, dando una mezcla de derivados de asparagina de la cadena de azúcar.

13. El procedimiento para preparar un derivado de asparagina de la cadena de azúcar según la reivindicación 1, que comprende las etapas de (a) introducir un grupo protector soluble en grasa seleccionado de grupo Fmoc, grupo t-butiloxicarbonilo (Boc) , grupo bencilo, grupo alilo, grupo aliloxicarbonato y grupo acetilo en la asparagina de la cadena de azúcar contenida en

una mezcla de una o más asparaginas de la cadena de azúcar, dando una mezcla de derivados de asparagina de la cadena de azúcar, en el que la mezcla de una o más asparaginas de la cadena de azúcar comprende asparaginas de lacadena de azúcar seleccionadas del grupo que consiste en:

(b) someter la mezcla de uno o más derivados de asparagina de la cadena de azúcar a cromatografía, para separar cada uno de los derivados de asparagina de la cadena de azúcar de los mismos.