Procedimiento modificado de fabricación de IRX-2.

Un método de fabricación y purificación de un compuesto biológico derivado de células primarias,

que contiene las citoquinas IL-1β, IL-2 e IFN-γ, cuyo método incluye las etapas secuenciales de:

(a)separación de células contaminantes de células mononucleares (MNCs) cargando leucocitos en un medio de separación de linfocitos (LSM), y lavando y centrifugando el medio;

(b) almacenamiento de las MNCs;

(c) estimulación de las MNCs con un mitógeno y ciprofloxacina en un sistema de cultivo celular desechable, para producir citoquinas;

(d) separación del mitógeno de las MNCs;

(e) incubación de las MNCs en un medio de cultivo; (f) separación de las MNCs del medio de cultivo, produciendo con ello un sobrenadante;

(g) separación de DNA del sobrenadante mediante cromatografía de intercambio aniónico; y

(h) separación de virus del sobrenadante cromatografiado que resulta.

caracterizado porque la etapa (a) se lleva a cabo con un sistema automatizado de tratamiento y lavado de células; la etapa (b) se lleva a cabo durante la noche en un sistema de bolsa estéril cerrada; la etapa (d) se lleva a cabo por filtración; la etapa (f) se lleva a cabo por filtración del medio de cultivo de las MNCs; y la etapa (h) se lleva a cabo por filtración con filtros dobles de 15 nanómetros en serie.

Procedimiento modificado de fabricación de IRX-2.

Campo de la invención La presente invención se refiere a un método de producción de cantidades grandes de compuestos biológicos. En particular, la presente invención se refiere a un procedimiento de fabricación aumentado proporcionalmente, de un compuesto biológico derivado de células primarias.

Antecedentes de la invención Descripción de la técnica relacionada Existen diversos métodos en la técnica utilizados para producir compuestos biológicos a partir de células, que, generalmente, implican las etapas de estimular células por incubación y lavado de las mismas para obtener el producto deseado.

Por ejemplo, la patente de EE.UU. No. 4.390.623 concedida a Fabricius, describe una preparación de factor de crecimiento de células T (interleuquina-2) , exenta de suero y desprovista de mitógenos, obtenida a partir de células mononucleares de sangre periférica humana, bovina o porcina que son lavadas varias veces con un medio líquido de cultivo de tejidos, y estimuladas después en un medio de cultivo de tejidos suplementado con suero y un mitógeno. Las células estimuladas separadas se lavan otra vez con medio de cultivo de tejidos de nueva aportación para separar sustancialmente la totalidad del suero y del mitógeno. Las células lavadas son suspendidas en medio de cultivo de tejidos de nueva aportación y acondicionadas en condiciones de incubación para transferir el factor de crecimiento al líquido. El medio de cultivo de tejidos separado de las células estimuladas, puede reciclarse para estimular mas células .El sobrenadante puede concentrarse de 50 a 100 veces sobre un ultrafiltro.

La patente de EE.UU. No. 4.406.830 concedida a Fabricius, describe un procedimiento de producción de interleuquina-1 (IL-1) (conocida también como factor de activación de linfocitos, LAF) , exenta de suero y libre de mitógenos, y de IL-2 exenta de suero y libre de mitógenos, por incubación de células mononucleares de sangre periférica (PBL) en un medio líquido de cultivo de tejidos exento de suero, para separar proteínas séricas residuales existentes sobre las superficies de las células PBL, activación de las células incubadas con un mitógeno, lavado de las células activadas con un líquido estéril para separar el mitógeno de las células y acondicionamiento de las células activadas exentas de suero y libre de mitógeno en un medio líquido de cultivo de tejidos para producir una interleuquina-1 (iL-1) exenta de suero y libre de mitógeno, poniendo en contacto el medio líquido de cultivo de tejidos que contiene IL-1 con nueva glicoproteína sérica sanguínea, e incubación de las células en presencia de iL-1 y de la nueva glicoproteína sérica sanguínea para inducir la síntesis de IL-2, y transferir la IL-2 (factor de crecimiento de células T) desde las células a la fase líquida del medio de cultivo de tejidos, produciendo con ello una IL-2 exenta de suero y libre de mitógeno..

La patente de EE.UU. No. 5.503.828, concedida a Testa, describe un método de producción de cantidades grandes de interferón-alfa por inducción y purificación. Se obtiene una mezcla de subtipos de interferón-alfa producida a partir de leucocitos de sangre periférica., mediante: (a) preparación de leucocitos de sangre periférica humana recogiendo capas anteadas y lisando hematíes con cloruro amónico, (b) suspensión de leucocitos con una densidad celular de 1-10x106 células/ml en un medio de inducción que comprende MEM de Eagle que contiene sales de Eagle, L-glutamina, aminoácidos no esenciales, Tricine, 4, 46 mg/ml, pH 7, 4, sulfato de neomicina, 24 !g/ml, vitaminas B3 y C, bicarbonato sódico, y entre 0, 1 a 1, 5 mg/ml de suero agamma humano, (c) adición de interferónalfa, crudo o purificado, como cebador, a los leucocitos suspendidos en el medio de inducción; (d) incubación de la suspensión durante un período de tiempo suficiente a aproximadamente 36 grados C al tiempo que se agita a 100300 rpm; (e) adición a la suspensión de entre 50-500 unidades de hemaglutinina por ml de virus Sendai; (f) incubación durante un período de tiempo suficiente a aproximadamente 36 grados C al tiempo que se agita a 100300 rpm; (h) centrifugación a aproximadamente 2.500 rpm para separar células y productos de desecho; e (i) recogida del interferón-alfa crudo obtenido como producto, sin separación de un subtipo de interferón-alfa de los otros subtipos de interferón-alfa presentes en la mezcla de alfa.

La patente de EE.UU. No. 6.350.589, concedida a Morris, describe un método de producción de interferones de tipo 1, multisubtipos. El método incluye las etapas de (a) cultivar leucocitos; (b) estimular los leucocitos para producir un interferón crudo; (c) concentrar el interferón crudo para separar contaminantes de bajo peso molecular; (d) reducir el volumen de líquido para producir un interferón crudo concentrado; (e) retirar una cantidad sustancial de albúmina sérica y otros contaminantes, del interferón crudo concentrado para producir una mezcla de interferones parcialmente purificada que contiene una pluralidad de subtipos; (f) separar sustancialmente la totalidad de la albúmina sérica restante y otros contaminantes de la mezcla de interferones parcialmente purificada para generar una mezcla de interferones que tiene una pureza de entre aproximadamente 50% y aproximadamente 80%; y (g) purificar la mezcla de interferones de aproximadamente 50% a 80% aproximadamente para producir una mezcla altamente purificada de interferón de Tipo I que tiene una pureza de al menos aproximadamente 95% y que contiene no más que aproximadamente 35% en peso de los subtipos IFN alfa-2 e INF alfa-8.

La patente de EE.UU. No. 6.896.879 concedida a Talor, describe un método de producción de una mezcla de citoquinas que está exenta de suero, libre de mitógeno y desprovista de antibióticos. En el procedimiento de fabricación, se separan células mononucleares procedentes de “capas anteadas” de donantes humanos por

centrifugación con gradiente escalonado y se cultivan con fitohemaglutinina (PHA) para intensificar la producción y secreción de IL-2 y otras citoquinas de los glóbulos blancos del donante en cultivo. Seguidamente, el sobrenadante del cultivo se recolecta asépticamente, se clarifica y se somete a un proceso comercial de exclusión de virus. Después el sobrenadante se concentra aproximadamente 10 veces mediante ultrafiltración y microfiltración. En este punto, se añade Albúmina de Suero Humana, Inyección de la Farmacopea de Estados Unidos, y el concentrado se tampona entonces a un pH fisiológico y se lleva a una concentración diana de IL-2 según la indicación de la etiqueta (por ejemplo, 400 UI/ml) . El concentrado se somete después a una segunda microfiltración (filtro de 0, 22 micrómetros) y se distribuye asépticamente en viales estériles del tipo de los del suero, y se etiquetan según su contenido de IL-2. La potencia del producto se mide mediante la incorporación de timidina radiomarcada por una línea linfoide-T citotóxica (CTLL-2) . El agente inyectable final se somete después a ensayo ELISA para determinar la presencia de cinco citoquinas marcadoras: IL-2, IL-10, GM-CSF, IFN-y y TNF-a.

Las patentes de EE.UU. Nos. 5.632.983, 5-698..194, 6.977.072, 7.153.499 y 7.182.942, concedidas a Hadden, describen un método de producción de una mezcla natural de citoquinas (NCM) que es una mezcla única de citoquinas de IL-11, IL-2, IL-8, INF-y, y TNF-a. Se recogen glóbulos blancos de capa anteada de sangre humana procedente de varios donantes negativos respecto a virus de hepatitis, y negativos respecto al HIV, . Las células de los donantes se agrupan y se distribuyen en capas sobre gradientes de ficoll hypaque (Pharmacia) , obteniendo linfocitos libres de neutrófilos y eritrocitos. En una realización preferida para la producción de NCM se lavan linfocitos y se distribuyen en medio X vivo-10 (Whitaker Bioproducts) en frascos. (MicroCELLector TM. T25 Cell Culture Flasks) en los que están estimulantes inmovilizados, es decir, mitógenos. El procedimiento de inmovilización para los estimulantes se realiza según está descrito por el fabricante, para inmovilizar diversas sustancias para llevar a cabo procesos operatorios de separación en placas, es decir separación de células, en los frascos. Las células se incuban se incuban durante 24-48 horas en medio X vivo-10 con ciprofloxacina, (Miles Lab) , 80 !g/ml, a 37ºC en un incubador de CO2/aire. Después de incubar los sobrenadantes se vierten totalmente y se recogen. Puede añadirse Albúmina de Suero Humana (HSA) para estabilizar las interleuquinas. Generalmente, la HSA se emplea en una concentración de 0, 1 a 0, 5% (peso en volumen) . Los sobrenadantes se mantienen a una temperatura... [Seguir leyendo]

1. Un método de fabricación y purificación de un compuesto biológico derivado de células primarias, que contiene las citoquinas IL-11, IL-2 e IFN-y, cuyo método incluye las etapas secuenciales de:

(a) separación de células contaminantes de células mononucleares (MNCs) cargando leucocitos en un medio de separación de linfocitos (LSM) , y lavando y centrifugando el medio;

(b) almacenamiento de las MNCs;

(c) estimulación de las MNCs con un mitógeno y ciprofloxacina en un sistema de cultivo celular desechable, para producir citoquinas;

(d) separación del mitógeno de las MNCs;

(e) incubación de las MNCs en un medio de cultivo;

(f) separación de las MNCs del medio de cultivo, produciendo con ello un sobrenadante;

(g) separación de DNA del sobrenadante mediante cromatografía de intercambio aniónico; y

(h) separación de virus del sobrenadante cromatografiado que resulta.

caracterizado porque la etapa (a) se lleva a cabo con un sistema automatizado de tratamiento y lavado de células; la etapa (b) se lleva a cabo durante la noche en un sistema de bolsa estéril cerrada; la etapa (d) se lleva a cabo por filtración; la etapa (f) se lleva a cabo por filtración del medio de cultivo de las MNCs; y la etapa (h) se lleva a cabo por filtración con filtros dobles de 15 nanómetros en serie.

2. Un método según la reivindicación 1, en donde dicha etapa (a) comprende, además, separar células contaminantes de MNCs procedentes de muchos donantes simultáneamente.

3. Un método según las reivindicaciones 1 ó 2, que se caracteriza, además, porque la etapa (a) comprende centrifugar a 1500 a 3000 rpm durante 20 minutos, para optimizar la separación de granulocitos y de hematíes 4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho mitógeno es fitohemaglutinina (PHA) .

5. Un método según la reivindicación 4, en donde dicha etapa (d) comprende reducir el nivel de PHA a menos de 150 ng/ml.

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que se caracteriza, además, porque la etapa (d) comprende filtrar en modo de flujo tangencial.

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la incubación en un medio de cultivo se realiza durante 24 horas.

8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que se caracteriza, además, porque el filtro de la etapa (h) es un filtro de 0, 45 micrómetros.

9. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la etapa (h) comprende aplicar luz ultravioleta-C (UVC) al sobrenadante para limpiar el sobrenadante cromatografiado de agentes adventicios.

10. Un método según la reivindicación 9, en donde la UVC se aplica uniformemente haciendo fluir en espiral el sobrenadante biológico derivado de células primarias, a lo largo de una fuente de irradiación de UVC.

11. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la ciprofloxacina está presente en una cantidad de 80 microgramos/ml, en la etapa (c) .

12. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicho medio de cultivo de la etapa (e) contiene 80 microgramos/ml de ciprofloxacina.

13. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que se caracteriza, además, porque las células mononucleares (MNCs) purificadas en la etapa (a) poseen un contenido de granulocitos menor que 5%.

14. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el método se caracteriza, además, porque la etapa (a) separa plaquetas a un nivel menor que 1, 2 x 1010 células.

15. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el compuesto biológico derivado de células primarias contiene, además, las citoquinas IL-6, IL-8 y TNF-a.