Presentación en la superficie celular de isoformas polipeptídicas mediante ultralectura de codón de terminación.

Método para seleccionar al menos una célula huésped eucariota que expresa un nivel deseado de un polipéptidode interés,

que comprende:

a) proporcionar una pluralidad de células huésped eucariotas que comprenden un ácido nucleico heterólogo quecomprende al menos un casete (Cas-POI) que comprende al menos un primer polinucleótido (Pn-POI) que codificapara el polipéptido de interés, al menos un codón de terminación en el sentido de 3' del primer polinucleótido y unsegundo polinucleótido en el sentido de 3' del codón de terminación que codifica para un anclaje transmembrana deinmunoglobulina;

b) cultivar las células huésped eucariotas para permitir la expresión del polipéptido de interés de manera que almenos una parte del polipéptido de interés se expresa como un polipéptido de fusión que comprende el anclajetransmembrana de inmunoglobulina, en el que dicho polipéptido de fusión está presentándose sobre la superficie dedicha célula huésped;

c) seleccionar al menos una célula huésped eucariota basándose en la presencia o cantidad del polipéptido defusión presentado sobre la superficie celular.

Presentación en la superficie celular de isoformas polipeptídicas mediante ultralectura de codón de terminación La presente invención se refiere a un método para seleccionar células huésped de mamífero de alta producción así como a vectores y a células huésped adecuados para su uso en un método respectivo. Además, la presente invención se refiere a un método para producir eficazmente polipéptidos con un alto rendimiento.

La selección de líneas celulares de alta producción es una primera etapa importante en el desarrollo de cualquier bioprocedimiento y es uno de los mayores desafíos en la biotecnología. Un problema es que tales clones de alta producción son raros, pueden gastar mucha de su energía en la producción de polipéptidos y por tanto tener tasas de crecimiento reducidas. Esto conduce a sobrecrecimiento y células no productoras o de baja producción. Sin embargo, en la producción de polipéptidos es deseable obtener líneas celulares que produzcan el polipéptido de interés con un alto rendimiento. Tradicionalmente, se seleccionaban líneas celulares de alta producción mediante rondas de clonación por dilución limitante seguido por análisis de productos. Sin embargo, esta ruta tradicional tiene varias desventajas ya que es tanto laboriosa como costosa. Más allá de eso, el procedimiento completo requiere mucho tiempo y puede tardar varios meses en completarse e incluso entonces no hay ninguna garantía de que la línea celular clónica sea estable y por tanto útil para el bioprocesamiento industrial. Además, la selección de los mayores productores puede verse comprometida por limitaciones prácticas en el número de células que pueden examinarse reduciéndose posiblemente de ese modo la eficacia de selección de células de alta productividad, de baja abundancia.

Por tanto, ha habido muchos esfuerzos para proporcionar métodos alternativos para seleccionar clones de alta producción. Por ejemplo, la citometría de flujo ha hecho que sea más fácil monitorizar la productividad y aislar células con características específicas. Las ventajas importantes de la citometría de flujo incluyen la capacidad para examinar rápidamente grandes números de células, con la capacidad para distinguir subpoblaciones de células y la capacidad para seleccionar eficazmente células de baja abundancia que demuestran las características deseadas. La mayoría de los enfoques tradicionales para seleccionar células de alta productividad utilizando citometría de flujo se establecieron para la selección de células de hibridoma.

Un enfoque se basa en el contenido en anticuerpos en la superficie celular de células de hibridoma que presentan una cantidad aumentada de anticuerpos en la superficie celular que pueden identificarse y recuperarse a través del uso de anticuerpos marcados con fluorescencia. Sin embargo, se no se ha documentado ampliamente una correlación cuantitativa.

El documento US 2005/0059082 describe bibliotecas de células a base de hibridomas que expresan anticuerpos en una forma unida a la membrana y en una forma secretada. El sistema descrito se basa en un mecanismo de corte y empalme alternativo usando intrones específicos.

Se desarrollaron enfoques adicionales para seleccionar células basándose en anticuerpo secretado como estrategia alternativa para sortear algunas de las limitaciones de la selección de anticuerpos en la superficie celular. Un enfoque aplica una matriz de afinidad; el otro usa una tecnología de microgotitas de gel. El primer método se basa en la creación de una matriz de afinidad artificial, específica para el producto de interés secretado. Las moléculas secretadas se unen a la matriz de afinidad sobre la superficie de la célula secretora y se marcan posteriormente con reactivos fluorescentes específicos para análisis por citometría de flujo y clasificación celular.

La encapsulación en microgotitas implica una encapsulación completa de células individuales en perlas de agarosa. Estas perlas contienen anticuerpos de captura específicos y de ese modo capturan simultáneamente el producto secretado e impiden la alimentación cruzada de producto entre células.

Otros métodos se basan en la coexpresión de genes de marcadores, que pueden detectarse mediante citometría de flujo. Las desventajas son una vinculación débil de la expresión del gen de marcador (por ejemplo proteína verde fluorescente) con la expresión del gen de interés. Además, la expresión del gen de marcador supone para las células un coste de energía adicional y puede inducir estrés.

Un método alternativo se basa en una coexpresión inducible de proteínas de captura unidas a la membrana. Las proteínas de captura unidas a la membrana se anclan a la superficie celular y capturan el polipéptido secretado en cuanto se liberan de las células. Esas moléculas capturadas pueden detectarse entonces sobre la superficie de la célula. Sin embargo, se necesitan células huésped modificadas por ingeniería genética y además puede producirse alimentación cruzada de células no productoras.

El documento WO 2005/07337 describe un sistema de selección para examinar y seleccionar células que expresan un alto nivel de polipéptido usando FACS. Para permitir la clasificación FACS, se usa un casete de expresión, en el que el gen que codifica para la proteína de interés está separado de la secuencia de anclaje a la membrana celular

por un codón de terminación. Si la traducción realiza la ultralectura del codón de terminación, se expresa una proteína de fusión en la que el anclaje a la membrana celular une la proteína de fusión a la membrana celular. Esta proteína de fusión puede detectarse mediante FACS. La tasa de ultralectura del codón de terminación se potencia añadiendo un agente de supresión de la terminación. El anclaje a la membrana celular preferido es el anclaje GPI. Adicionalmente, se describe el anclaje PDGFR.

También se han usado productos secretados asociados de manera transitoria a la membrana celular con el fin de seleccionar células productoras. Sin embargo, se produce alimentación cruzada de células no productoras y este método tiene una actividad de fondo bastante alta. Además, se encontró que no es posible realizar varias rondas de enriquecimiento y selección.

Por tanto, hay una necesidad de desarrollar una tecnología para selección células huésped de alta producción. Por tanto, el objeto de la presente invención es proporcionar un método para detectar células huésped recombinantes de alta producción dentro de una población grande de células de producción baja, media y/o no productoras y proporcionar un método para producir polipéptidos con un alto rendimiento.

La presente invención soluciona este problema proporcionando un método para enriquecer o seleccionar al menos una célula huésped eucariota que expresa un nivel deseado de un polipéptido de interés, que comprende:

a) proporcionar una pluralidad de células huésped eucariotas que comprenden un ácido nucleico heterólogo que comprende al menos un casete (Cas-POI) que comprende al menos un primer polinucleótido (Pn-POI) que codifica para el polipéptido de interés, al menos un codón de terminación en el sentido de 3’ del primer polinucleótido y un segundo polinucleótido en el sentido de 3’ del codón de terminación que codifica para un anclaje transmembrana de inmunoglobulina;

b) cultivar las células huésped eucariotas para permitir la expresión del polipéptido de interés de manea que al menos una parte del polipéptido de interés se expresa como un polipéptido de fusión que comprende el anclaje transmembrana de inmunoglobulina, en el que dicho polipéptido de fusión está presentándose sobre la superficie de dicha célula huésped;

c) seleccionar al menos una célula huésped eucariota basándose en la presencia o cantidad del polipéptido de fusión presentado sobre la superficie celular.

Un “ácido nucleico heterólogo” se refiere a una secuencia de polinucleótido que se ha introducido en una célula huésped por ejemplo mediante el uso de técnicas recombinantes tales como transfección. La célula huésped puede comprender o no un polinucleótido endógeno correspondiente, respectivamente idéntico, al polinucleótido heterólogo. Sin embargo, en particular, el término “ácido nucleico heterólogo” se refiere a un polinucleótido foráneo introducido en la célula huésped. La introducción puede lograrse, por ejemplo, transfectando un vector adecuado que puede integrarse en el genoma de la célula huésped (transfección estable) . En el caso de que el ácido nucleico heterólogo no se inserte en el genoma, el ácido nucleico heterólogo puede... [Seguir leyendo]

1. Método para seleccionar al menos una célula huésped eucariota que expresa un nivel deseado de un polipéptido de interés, que comprende:

a) proporcionar una pluralidad de células huésped eucariotas que comprenden un ácido nucleico heterólogo que comprende al menos un casete (Cas-POI) que comprende al menos un primer polinucleótido (Pn-POI) que codifica para el polipéptido de interés, al menos un codón de terminación en el sentido de 3’ del primer polinucleótido y un segundo polinucleótido en el sentido de 3’ del codón de terminación que codifica para un anclaje transmembrana de inmunoglobulina;

b) cultivar las células huésped eucariotas para permitir la expresión del polipéptido de interés de manera que al menos una parte del polipéptido de interés se expresa como un polipéptido de fusión que comprende el anclaje transmembrana de inmunoglobulina, en el que dicho polipéptido de fusión está presentándose sobre la superficie de dicha célula huésped;

c) seleccionar al menos una célula huésped eucariota basándose en la presencia o cantidad del polipéptido de fusión presentado sobre la superficie celular.

2. Método para producir un polipéptido de interés con alto rendimiento, comprendiendo el método:

a) proporcionar una pluralidad de células huésped eucariotas que comprenden un ácido nucleico heterólogo que comprende al menos un casete (Cas-POI) que comprende un primer polinucleótido (Pn-POI) que codifica para el polipéptido de interés, al menos un codón de terminación en el sentido de 3’ del primer polinucleótido y un segundo polinucleótido en el sentido de 3’ del codón de terminación que codifica para un anclaje transmembrana de inmunoglobulina;

b) cultivar las células huésped eucariotas para permitir la expresión del polipéptido de interés de manera que al menos una parte del polipéptido de interés se expresa como un polipéptido de fusión que comprende el anclaje transmembrana de inmunoglobulina o una variante funcional del mismo, en el que dicho polipéptido de fusión está presentándose sobre la superficie de dicha célula huésped;

c) seleccionar al menos una célula huésped eucariota basándose en la presencia o cantidad del polipéptido de fusión presentado sobre la superficie celular;

d) cultivar la célula huésped eucariota seleccionada en medio de cultivo en condiciones que permiten la expresión del polipéptido de interés.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la expresión del casete (Cas-POI) da como resultado un transcrito que comprende al menos

- un primer polinucleótido, en el que la traducción de dicho primer polinucleótido da como resultado el polipéptido de interés;

- al menos un codón de terminación en el sentido de 3’ de dicho primer polinucleótido;

- un segundo polinucleótido en el sentido de 3’ de dicho codón de terminación, en el que la traducción de dicho segundo polinucleótido da como resultado el anclaje transmembrana de inmunoglobulina,

en el que al menos una parte del transcrito se traduce para dar un polipéptido de fusión que comprende el anclaje transmembrana de inmunoglobulina o una variante funcional del mismo mediante ultralectura traduccional del al menos un codón de terminación.

4. Método según al menos una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anclaje transmembrana de inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste en a) un anclaje transmembrana derivado de IgA, IgE, IgM, IgG y/o IgD,

b) un anclaje transmembrana de inmunoglobulina que comprende un dominio citoplasmático, y

c) un anclaje transmembrana de inmunoglobulina que comprende una secuencia tal como se muestra en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y/o SEQ ID NO: 7.

5. Método según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la etapa c) comprende poner en contacto la pluralidad de células huésped eucariotas con un compuesto de detección que se une al polipéptido de fusión y seleccionar al menos una célula huésped eucariota basándose en la presencia o cantidad del compuesto de detección unido.

6. Método según al menos una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la ultralectura del codón de terminación da como resultado aproximadamente ≤ 50%, ≤ 25%, ≤ 15%, ≤ 10%, ≤ 5%, ≤ 2, 5%, ≤ 1, 5%, ≤ 1% o menos de ≤ 0, 5% del polipéptido de fusión.

7. Método según al menos una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que se realizan dos o más ciclos de selección, en el que en cada ciclo de selección se selecciona al menos una célula huésped eucariota basándose en la presencia o cantidad del polipéptido de fusión presentado sobre la superficie celular.

8. Método según al menos una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la unión del compuesto de detección a la superficie de la célula huésped eucariota se detecta mediante citometría de flujo.

9. Ácido nucleico vector adecuado para expresar al menos un polipéptido de interés en una célula huésped eucariota y adecuado para su uso en el método de selección según una o más de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende

a) al menos un casete (Cas-POI) que comprende un sitio de inserción para un primer polinucleótido (Pn-POI) que codifica para el polipéptido de interés y/o un primer polinucleótido que codifica para un polipéptido de interés,

b) al menos un codón de terminación en el sentido de 3’ de dicho sitio de inserción y/o en el sentido de 3’ del primer polinucleótido, y

c) un segundo polinucleótido en el sentido de 3’ del codón de terminación que codifica para un anclaje transmembrana de inmunoglobulina.

10. Ácido nucleico vector según la reivindicación 9, que comprende al menos una de las siguientes características:

- un primer polinucleótido (Pn-POI) que codifica para el polipéptido de interés en el casete (Cas-POI) ;

- un casete de expresión (MSM) que comprende un gen de marcador seleccionable de mamífero; y/o

- un casete de expresión (MASM) que comprende un gen de marcador seleccionable amplificable de mamífero.

11. Ácido nucleico vector según la reivindicación 9 ó 10 para expresar al menos una molécula de inmunoglobulina o una variante funcional de la misma, que comprende

- un casete de expresión (Exp-POI) que comprende un primer polinucleótido que codifica para la cadena pesada de una molécula de inmunoglobulina o un fragmento funcional de la misma, al menos un codón de terminación en el sentido de 3’ del primer polinucleótido y un segundo polinucleótido en el sentido de 3’ del codón de terminación que codifica para un anclaje transmembrana de inmunoglobulina; y

- un casete de expresión adicional (Exp-POI’) que comprende un polinucleótido que codifica para la cadena ligera correspondiente de una molécula de inmunoglobulina o un fragmento funcional de la misma.

12. Método para producir un ácido nucleico vector según al menos una de las reivindicaciones 9 a 11, comprendiendo el método ensamblar al menos un casete (Cas-POI) en un vector de manera que dicho casete (Cas-POI) comprende un primer polinucleótido (Pn-POI) que codifica para el polipéptido de interés, al menos un codón de terminación en el sentido de 3’ del primer polinucleótido y un segundo polinucleótido en el sentido de 3’ del codón de terminación que codifica para un anclaje transmembrana de inmunoglobulina.

13. Célula huésped eucariota que tiene al menos una de las siguientes características:

a) se obtiene mediante el método según al menos una de las reivindicaciones 1 a 8;

b) comprende un casete (Cas-POI) que comprende al menos un polinucleótido heterólogo que codifica para un polinucleótido de interés, al menos un codón de terminación en el sentido de 3’ de dicho polinucleótido heterólogo y un polinucleótido en el sentido de 3’ del codón de terminación que codifica para un anclaje transmembrana de inmunoglobulina; y/o c) comprende un ácido nucleico vector según al menos una de las reivindicaciones 9 a 11.

14. Método para producir un polipéptido de interés, en el que se cultiva una célula huésped eucariota según la reivindicación 13 para expresar el polipéptido de interés.

15. Método para producir un polipéptido de interés según una de las reivindicaciones 2 a 8 ó 14, en el que se realiza al menos una de las siguientes etapas:

- se obtiene el polipéptido a partir del cultivo celular;

- se secreta el polipéptido al, y se obtiene del, medio de cultivo;

- se rompen las células huésped eucariotas para obtener el polipéptido expresado;

- se aísla el polipéptido expresado;

- se purifica el polipéptido expresado; y/.

10. se procesa y/o se purifica adicionalmente el polipéptido expresado.