Procedimiento para preparar análogos de insulina con extremo de cadena B dibásico.

Procedimiento para preparar un análogo de insulina o un derivado del mismo,

en el que el análogo de insulina se caracteriza por la fórmula general I **Fórmula**

en donde significan

(A1-A5) los restos aminoácidos en las posiciones A1 hasta A5 de la cadena A de la insulina humana o animal,

(A12-A19) los restos aminoácidos en las posiciones A12 hasta A19 de la cadena A de la insulina humana o animal, A21 un resto aminoácido de origen natural,

(B8-B18) los restos aminoácidos en las posiciones B8 hasta B18 de la cadena B de la insulina humana o animal,

(B20-B26) los restos aminoácidos en las posiciones B20 hasta B26 de la cadena B de la insulina humana o animal,

(A8-A10) los restos aminoácidos en las posiciones A8 hasta A10 de la cadena A de la insulina 15 humana o animal,

B30 un enlace químico o un resto aminoácido de origen natural,

B1 un enlace químico o un resto aminoácido de origen natural,

B3 un resto aminoácido de origen natural.

Procedimiento para preparar análogos de insulina con extremo de cadena B dibásico.

La invención se refiere a un procedimiento para preparar una insulina con extremo de cadena dibásico, en el que se prepara de forma biotecnológica un precursor de la misma y, a continuación, en una reacción de ligadura catalizada enzimáticamente con lisinamida o argininamida, o lisina o arginina modificadas por grupos protectores y, opcionalmente, subsiguiente hidrólisis, se convierte en esta insulina.

Alrededor de 177 millones de personas en el mundo padecen diabetes mellitus. Esta cifra incluye aproximadamente 17 millones de diabéticos de tipo I, en los que el tratamiento de sustitución para la ausencia de secreción de insulina endocrina es actualmente la única terapia posible. Los afectados dependen de inyecciones de insulina, normalmente varias veces al día, durante toda la vida. Al contrario que en la diabetes de tipo I, en la diabetes de tipo II no existe en principio una deficiencia de insulina, si bien en un gran número de casos, especialmente en la fase avanzada, el tratamiento con insulina, combinado eventualmente con un antidiabético oral, se considera como la forma de terapia más favorable.

En personas sanas, la liberación de insulina está estrictamente vinculada a la concentración de glucosa en sangre. Las concentraciones elevadas de glucosa en sangre tales como las que se producen después de las comidas se compensan rápidamente por un correspondiente aumento en la secreción de insulina. En ayunas, la concentración de insulina en plasma se reduce hasta un valor basal que es suficiente para asegurar un suministro continuo de glucosa a órganos y tejidos sensibles a la insulina, y para mantener baja la producción de glucosa hepática durante la noche. Por lo general, en la sustitución de la secreción de insulina endógena con administración de insulina exógena, a menudo por vía subcutánea, no se alcanza la calidad de la regulación fisiológica de la glucosa en sangre descrita anteriormente. Son frecuentes las restructuraciones ascendentes o descendentes de la concentración de glucosa en sangre que, en sus formas más graves, pueden ser potencialmente mortales. Además, las concentraciones elevadas de glucosa en sangre a lo largo de varios años representan, incluso en ausencia de síntomas iniciales, un considerable riesgo para la salud. El estudio DCCT a gran escala realizado en EE.UU. (The Diabetes Control and Complications Trial Research Group (1993) N. Engl. J. Med. 329, 977-986) demuestra inequívocamente que las concentraciones de glucosa en sangre crónicamente elevadas son esencialmente responsables del desarrollo de complicaciones diabéticas tardías. Las complicaciones diabéticas tardías son lesiones micro-y macrovasculares que, bajo determinadas circunstancias, se manifiestan, entre otras, como retinopatías, nefropatías o neuropatías y provocan ceguera, insuficiencia renal y pérdida de las extremidades, asociándose además con un mayor riesgo de trastornos cardiovasculares. De todo esto se deduce que un tratamiento mejorado de la diabetes debe aspirar principalmente a mantener la glucosa en sangre dentro de un intervalo lo más fisiológico posible. El concepto de tratamiento intensivo con insulina pretende conseguirlo mediante múltiples inyecciones diarias de preparaciones de insulina de acción rápida y lenta. Las formulaciones de acción rápida se administran a las horas de las comidas para compensar el aumento postprandial en la glucosa en sangre. Las insulinas basales de acción lenta deben asegurar el suministro básico de insulina, especialmente durante la noche, sin que se produzca una hipoglucemia.

La insulina es un polipéptido formado por 51 aminoácidos divididos en 2 cadenas de aminoácidos: la cadena A con 21 aminoácidos y la cadena B con 30 aminoácidos. Las cadenas se unen entre sí por 2 puentes disulfuro. Las preparaciones de insulina se han empleado desde hace muchos años para el tratamiento de la diabetes. Por otra parte, no sólo se usan insulinas disponibles en la naturaleza, sino que más recientemente se emplean también derivados y análogos de insulina.

Los análogos de insulina son análogos de insulinas de origen natural, a saber insulina humana o insulinas animales, que difieren por la sustitución de al menos un resto aminoácido de origen natural con otros restos aminoácidos y/o la adición/deleción de al menos un resto aminoácido de la insulina de origen natural correspondiente que, por lo demás, es idéntica. El documento US 5.656.722 describe, por ejemplo, derivados de insulina des-Phe (B1) . Los restos aminoácidos agregados y/o sustituidos pueden incluir también restos que no se encuentran presentes de forma natural.

Los derivados de insulina son derivados de insulinas de origen natural o análogos de insulina, en los que se sustituye uno o múltiples restos aminoácidos y/o los extremos N o C-terminales de las cadenas A y/o B con grupos funcionales. Los grupos funcionales se seleccionan de un grupo que contiene restos amida, restos amina, restos carboxilo, restos alquilo, restos alcohol y restos alcoxi.

Un tratamiento de insulina eficaz recurre al uso de las llamadas insulinas basales. Por esta expresión se entienden formulaciones que hacen posible una liberación lenta y continua de la insulina administrada de manera exógena. De esta manera, se consigue una concentración de insulina basal en el organismo durante un periodo prolongado, con efectos ventajosos sobre el estado fisiológico de la persona enferma de diabetes.

El análogo recombinante de la insulina humana Gly (A21) , Arg (B31) , Arg (B32) (insulina glargina) se distingue por que sólo se debe administrar al organismo cada 24 horas, es decir, una vez al día para lograr un efecto basal. La administración una vez al día mejora la calidad de vida. La fisiología mejorada conduce, por ejemplo, a una reducción del nivel de Hba1c y cabe esperar que, gracias a esta mejora, las consecuencias tardías de la diabetes se manifiesten - si lo hacen - considerablemente más tarde, lo que permite prolongar la esperanza de vida del diabético afectado.

La demanda de este análogo de la insulina es correspondientemente elevada. Puesto que el número de diabéticos aumenta de forma continua, la minimización de los costes de preparación de los correspondientes análogos reviste un gran interés económico. En el documento US 5.656.722 se describe la posible preparación de análogos de insulina mediante una proteína de fusión de preproinsulina que consiste en una porción de fusión (“porción pre”) y

una variante de proinsulina de mono. Uno de los análogos descritos comprende glicina en vez de asparagina en la posición A (21) . La proteína de fusión correspondiente es una variante del precursor peptídico para la preparación de insulina glargina. El procedimiento prevé que, a partir de esta proteína de fusión, se separen la porción pre y el péptido C por reacción con tripsina. El documento EP-A 0 668 292 describe una proteína de fusión que sigue el mismo principio, pero permite preparar insulina glargina a través de un procedimiento mejorado con respecto al del documento US 5.656.722. En este sentido, para el experto resulta evidente que, en especial en el límite de las cadenas B y C de la insulina que se define por la estructura dibásica Arg-Arg, es posible llevar a cabo una escisión parcial que da lugar a un análogo de insulina humana mono-Arg B31. Este producto defectuoso se debe retirar del verdadero compuesto de interés. Esto conduce a una considerable disminución del rendimiento. El problema se puede eludir por la preparación por tecnología génica de proinsulinas y la reacción de estas con una endoproteasa específica tal como, por ejemplo, lisil endopeptidasa, haciendo reaccionar, en una estrategia de química semisintética de péptidos, la insulina humana des-B30 (análogo) resultante con el tripéptido Thr-Arg-Arg. Los documentos EP-A 0 132 769 y WO 2003/044210 describen que los grupos reactivos del tripéptido deben estar protegidos durante la reacción. Los grupos protectores se eliminan después de la reacción. Esta vía se asocia con los costes originados por la preparación del tripéptido por síntesis química y la introducción de grupos protectores. Igualmente, sería deseable disponer de un procedimiento que permita preparar análogos de insulina Arg (B31) , Arg (B32) a partir del precursor de insulina humana Arg (B31) .

La solicitud de patente alemana No. 10 2005 046 113.1 (no publicada) describe un procedimiento que incluye la ligadura catalizada con tripsina de aminoácidos con amidación C-terminal a péptidos cuyo aminoácido C-terminal está formado por lisina o arginina. Los rendimientos observados en este caso son sorprendentemente... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para preparar un análogo de insulina o un derivado del mismo, en el que el análogo de insulina se caracteriza por la fórmula general I

en donde significan (A1-A5) los restos aminoácidos en las posiciones A1 hasta A5 de la cadena A de la insulina humana o animal, (A12-A19) los restos aminoácidos en las posiciones A12 hasta A19 de la cadena A de la insulina humana o animal, 10 A21 un resto aminoácido de origen natural, (B8-B18) los restos aminoácidos en las posiciones B8 hasta B18 de la cadena B de la insulina humana o animal, (B20-B26) los restos aminoácidos en las posiciones B20 hasta B26 de la cadena B de la insulina humana o animal, 15 (A8-A10) los restos aminoácidos en las posiciones A8 hasta A10 de la cadena A de la insulina humana o animal, B30 un enlace químico o un resto aminoácido de origen natural, B1 un enlace químico o un resto aminoácido de origen natural, B3 un resto aminoácido de origen natural,

B27, B28 y B29 un resto aminoácido de origen natural, R1 un grupo amino o uno hasta tres restos aminoácidos de origen natural, R2 un grupo carboxi o uno hasta tres restos aminoácidos de origen natural, R3 un grupo amino o uno hasta tres restos aminoácidos de origen natural, 25 R4 significa un aminoácido básico,

R5 un resto aminoácido básico, cuyo extremo C-terminal se encuentra libre o amidado, en donde el resto aminoácido cuyo extremo C-terminal está conectado con el extremo N-terminal de R5 se selecciona de un grupo que comprende Arg y Lys;

en donde

a un análogo de insulina inicial o un derivado del mismo, en donde el análogo de insulina inicial se caracteriza por la fórmula general II

en la que R1, (A1-A5) , (A8-A10) , (A12-A19) , A21, R2, R3, B1, B3, (B8-B18) , (B20-B26) , B27, B28, B29, B30 5 y R4 se definen como en la Fórmula I y el resto aminoácido C-terminal de la cadena B se selecciona a partir de un grupo que contiene Arg y Lys,

a uno de los citados aminoácidos C-terminales se agrega, en presencia de una enzima con la actividad biológica de tripsina, un aminoácido básico de origen natural, amidado o protegido en su extremo Cterminal con un grupo protector, seleccionado del grupo de Arg y Lys,

y se purifica el análogo de insulina modificado que se obtiene y, opcionalmente, se separa el grupo amida o el grupo protector C-terminal del aminoácido agregado.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el análogo de insulina modificado es insulina humana Gly (A21) , Arg (B31) , Arg (B32) , cuyo extremo C-terminal de la cadena B está amidado.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el análogo de insulina inicial es insulina humana Gly (A21) , 15 Arg (B31) .

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el análogo de insulina inicial se prepara por expresión recombinante de una proteína precursora que contiene las cadenas A y B del análogo de insulina inicial.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que se expresa un gen que es parte de un replicón.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4 o 5, en el que como célula hospedadora se utiliza una bacteria o una levadura.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4 a 6, en el que la proteína precursora se segrega después de la expresión.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la proteína precursora se aísla a partir del sobrenadante celular 25 de bacterias o levaduras.

9. Procedimiento para preparar análogos de insulina modificados según la reivindicación 6, en el que la proteína precursora se aísla a partir del periplasma de una bacteria.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4 a 7, en el que la proteína precursora obtenida según una de las reivindicaciones citadas se somete a un proceso de plegado y a escisión enzimática.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el análogo de insulina inicial se prepara por expresión directa recombinante.

12. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la enzima con actividad biológica de tripsina se selecciona de un grupo que contiene tripsina humana, tripsina porcina, tripsina bovina y una variante de tripsina humana, tripsina porcina y tripsina bovina.

13. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la enzima posee actividad de lisil endopeptidasa.

14. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el extremo C-terminal de la cadena B

del análogo de insulina modificado se desprotege posteriormente en una reacción de hidrólisis.

15. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el análogo de insulina obtenido es insulina humana Gly (A21) , Arg (B31) , Arg (B32) .