Polipéptidos sintéticos derivados de pre-S1 del virus de la hepatitis B y usos de los mismos.

Un polipéptido sintético aislado que tiene la secuencia aminoacídica de fórmula X-Y-Z,

en la que

- X es un radical amino o un aminoácido o está ausente;

- Y es la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO 2;

-Z, ligado al grupo -CO- del último residuo de Y, es un grupo amino o secuencia aminoacídica que comprende de 1 a 30 aminoácidos consecutivos de la región pre-S1 mostrada en la SEQ ID NO 3, o está ausente;

o una secuencia aminoacídica homóloga de dicha secuencia X-Y-Z de HBV cepa ¬alpha;1, HBV cepa LSH, HBV de marmota, HBV de mono lanudo o los subtipos de HBV ad, adr, adw, adyw, ar o ayw;

estando dichos polipéptidos modificados químicamente para portar un resto hidrófobo.

Polipéptidos sintéticos derivados de pre-S1 del virus de la hepatitis B y usos de los mismos La presente invención se refiere a nuevos polipéptidos y derivados de los mismos que bloquean la infección por hepatitis B en una etapa temprana.

Los hepadnavirus son un grupo de virus de ADN parcialmente bicatenario de cubierta pequeña que se han encontrado en mamíferos y aves. El virus de la hepatitis B humano (HBV) , que representa el prototipo de este grupo, causa hepatitis aguda y crónica en el hombre. Las infecciones por HBV representan un grave problema sanitario, que conduce estimadamente a un millón de muertes al año.

El ciclo de replicación intracelular de los hepadnavirus, en particular la transcripción de ADN vírico, empaquetamiento y transcripción inversa de ARN genómico y el establecimiento de un conjunto intracelular de ADN de HBV circular cerrado covalentemente se ha dilucidado con cierto detalle (Nassal et al., 1993; Nassal et al., 1996) . Sin embargo, hasta ahora la falta de una estirpe celular infectable por HBV y la disponibilidad limitada de hepatocitos humanos primarios para los estudios de infección in vitro han evitado implacablemente el progreso de la comprensión de las etapas tempranas de la infección por HBV. Por consiguiente, se han propuesto una variedad de candidatos a receptor de HBV basándose en estudios de unión (revisados por DeMeyer et al., 1997) , pero en ninguno de ellos pudo demostrarse convincentemente que estuviera implicado en el proceso de entrada.

Sin embargo, se han hecho más progresos recientemente al determinar los requisitos de secuencia para la infección en las proteínas de cubierta de virus de la hepatitis B de pato y humano (Urban et al., 1998, LeSeyec et aI., 1998, LeSeyec et aI., 1999) .

La envoltura vírica del HBV contiene las proteínas de cubierta vírica grande (L) , mediana (M) y pequeña (S) . Los hepadnavirus aviares comprenden solo las proteínas L y S. Las proteínas de superficie de todos los hepadnavirus están codificadas en marcos de lectura abiertos individuales del ADN vírico de tal modo que la proteína L contiene el dominio S completo que sirve como anclaje en la bicapa lipídica derivada de la membrana RE. En el caso de HBV, las proteínas L y M difieren de la proteína S en una extensión N-terminal hidrófila de 163 a 174 aminoácidos, denominada pre-S. Esta extensión pre-S se divide adicionalmente en un dominio pre-S2 (55 aminoácidos) y otro pre-S1 (108 aminoácidos de subtipo ayw) , hacia el extremo amino. Dependiendo del subtipo de HBV, el dominio pre-S1 muestra cierta variación de secuencia y, en el caso del subtipo adr, porta una inserción de 11 aminoácidos adicionales.

El análisis de la infectividad de HBV seudotipados que portan mutaciones en la parte pre-S exterior de la proteína L ha mostrado que la infección depende de una secuencia extendida en el dominio pre-S1 de la proteína L de HBV (Le Seyec, 1999) . En contraposición, la mayoría de partes del dominio pre-S2 resultaron ser prescindibles para la infectividad (Le Seyec et al., 1998) . Esto indica que la secuencia entre los aminoácidos 3 y 77 del dominio pre-S1 está implicada en la etapa de infección.

Debido a la disponibilidad de hepatocitos de pato primarios, se ha conseguido un mayor progreso en el sistema modelo de virus de la hepatitis B de pato relacionado. Usando este sistema, se mostró que los polipéptidos de pre-S derivados de E. coli de la proteína L del virus de la hepatitis B de pato inhiben la infección por DHBV de hepatocitos de pato primarios al interferir con la unión a receptor (Urban et al., 1998) . Se demostró adicionalmente que la proteína de unión a DHBV-preS carboxipeptidasa D, inicialmente identificada por Kuroki et aI., (1994) funciona como componente receptor común para los HBV aviares (Urban et al., 1998; Breiner et al., 1998; Urban et al., 2000) (véanse también los documentos EP 1.088.830 A; EP 0.485.361 A; WO 99/15671 A; EP 0.250.253 A; WO 91/05059 A; US 4.935.235 A; Gripon, P. et al. (1995) , Virology 213: 292-299; Neurath, AR et al. (1987) , Molecular Immunology

24: 975-980) .

En el caso de infección por HBV, sigue faltando un estado de conocimiento similar y todavía no hay evidencias experimentales de componentes peptídicos que interfieran eficazmente con las etapas tempranas de una infección por HBV.

Los autores de la presente invención han investigado si los polipéptidos de pre-S derivados de E. coli recombinante y los péptidos de pre-S de proteína L de HBV sintetizados químicamente podían interferir con una infección por HBV.

Han identificado un grupo de péptidos sintéticos que, a la vez que exhiben una excelente actividad inhibidora directa de la infección por HBV, hacen posible desencadenar una protección inmunitaria frente a HBV.

Estos polipéptidos se diseñaron a partir de la secuencia de los aminoácidos 1 a 78 de pre-S1 (SEQ ID NO 1) del virus de la hepatitis B subtipo ayw. Sin embargo, aunque estos polipéptidos son más cortos que la región pre-S1, sorprendentemente muestran una mejor actividad inhibidora que polipéptidos más largos que imitarían la región pre-S1 entera.

Los polipéptidos sintéticos aislados de la presente invención como se definen en las reivindicaciones tienen la secuencia aminoacídica de fórmula:

X-Y-Z (I)

en la que:

- X es un aminoácido, por ejemplo una metionina, o está ausente;

- Y es la secuencia aminoacídica 2 a 48 de la región pre-S1 mostrada en la SEQ ID NO 2, o una forma truncada Nterminal y/o C-terminal de esta secuencia;

- Z, ligado al grupo –CO- del último residuo de Y, es una secuencia aminoacídica que comprende 1 a 30 aminoácidos consecutivos de la región pre-S1 mostrada en la SEQ ID NO 3, o está ausente;

estando dichos polipéptidos opcionalmente modificados químicamente para portar un resto hidrófobo.

Preferiblemente, cuando Y es una forma truncada C-terminal, y opcionalmente N-terminal, de la secuencia SEQ ID NO 2, o una variante de la misma, Z está ausente.

Preferiblemente, el resto hidrófobo corresponde al resto acilo de un ácido graso saturado o insaturado que tiene al menos 4 átomos de carbono, preferiblemente al menos 6 átomos de carbono, más preferiblemente al menos 8 átomos de carbono, tal como ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, oleato, linoleato, linolenato o araquidonato, por ejemplo, o el resto hidrófobo corresponde a un grupo colesterol o similar.

En una realización preferida, los polipéptidos de la presente invención están miristoilados. Más preferiblemente, los polipéptidos comprenden la secuencia aminoacídica entera de 2 a 48 de SEQ ID NO 1, portando el aminoácido 2 (glicina) un grupo miristilo: MyrGQNLSTSNPLGFFPOHQLOPAFRANTANPDWOFNPNKDTWPDANKVG (Myr 2-48, SEQ ID NO 7) .

En otra realización, el polipéptido de la invención tiene la secuencia SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 o SEQ ID NO 7.

El término “variante” hace referencia a las secuencias polinucleotídicas homólogas encontradas en diferentes especies víricas, cepas o subtipos del género hepadnavirus, tales como HBV cepa α1, HBV cepa LSH (aislamiento de chimpancé) , HBV de marmota, HBV de mono lanudo (WMHBV) , o cepas seleccionadas del grupo consistente en los subtipos de HBV AD, ADR, ADW, ADYW, AR y AYW.

Cualquier análogo de los polipéptidos sintéticos de pre-S1 es parte de la presente divulgación. Los análogos implican deleciones aminoacídicas, sustituciones aminoacídicas tales como por reemplazo conservativo o no conservativo por otros aminoácidos o por isósteros (aminoácidos modificados que ostentan una similitud estructural y espacial parecida a los aminoácidos proteicos) , adiciones aminoacídicas o adiciones isostéricas, a condición de que las secuencias desencadenen un 70% de inhibición de la infección por HBV de cultivos primarios de hepatocitos humanos con una concentración peptídica menor de 100 µM, preferiblemente menor de 10 µM, y preferiblemente menor de 1 µM.

Las sustituciones aminoacídicas conservativas se refieren típicamente a sustituciones entre aminoácidos de la misma clase. Estas clases incluyen, por ejemplo, aminoácidos que tienen cadenas laterales polares no cargadas, tales como asparagina, glutamina, serina, treonina y tirosina; aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas, tales como lisina, arginina e histidina; aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas, tales como ácido aspártico y ácido glutámico y aminoácidos que tienen cadenas laterales no polares, tales como glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano y cisteína.

Ventajosamente, los péptidos según la invención... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido sintético aislado que tiene la secuencia aminoacídica de fórmula X-Y-Z, en la que

- X es un radical amino o un aminoácido o está ausente;

- Y es la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO 2;

-Z, ligado al grupo –CO- del último residuo de Y, es un grupo amino o secuencia aminoacídica que comprende de 1 a 30 aminoácidos consecutivos de la región pre-S1 mostrada en la SEQ ID NO 3, o está ausente;

o una secuencia aminoacídica homóloga de dicha secuencia X-Y-Z de HBV cepa α1, HBV cepa LSH, HBV de marmota, HBV de mono lanudo o los subtipos de HBV ad, adr, adw, adyw, ar o ayw;

estando dichos polipéptidos modificados químicamente para portar un resto hidrófobo.

2. Un polipéptido aislado según la reivindicación 1, en el que la modificación química es miristoilación.

3. Un polipéptido aislado según la reivindicación 2, en el que el aminoácido 1 de la SEQ ID NO 2 está miristoilado.

4. Un polipéptido aislado según las reivindicaciones 1 a 3, que tiene la secuencia aminoacídica SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 7 o SEQ IO NO 14.

5. Un polipéptido aislado que tiene la secuencia aminoacídica SEQ ID NO 8 o SEQ ID NO 10.

6. Uso de un polipéptido de las reivindicaciones 1 a 5 para la fabricación de un medicamento para la inhibición de la infección por HBV.

7. El uso según la reivindicación 6, en el que dicho medicamento es para prevenir la unión a y/o la internalización en hepatocitos de partículas de HBV.

8. Método de inhibición in vitro de infección de hepatocitos por HBV que comprende usar un polipéptido de las reivindicaciones 1 a 5.

9. Método de identificación in vitro de un receptor de hepatocito implicado en el ligamiento y/o penetración de HBV que comprende las etapas de:

a) poner en contacto una biopsia hepática o hepatocito con un polipéptido de las reivindicaciones 1 a 5 en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la unión específica de dicho polipéptido a un receptor expresado en la superficie del hepatocito;

b) detectar la unión de dicho polipéptido a un receptor; y

c) identificar dicho receptor.

10. Método para el diagnóstico ex vivo de infección por HBV que comprende las etapas de:

a) poner en contacto una muestra biológica con el polipéptido de las reivindicaciones 1 a 5 en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo entre dicho polipéptido y un anticuerpo presente en una muestra biológica y dirigido hacia un fragmento de la región pre-S1 de partículas víricas de HBV; y

b) detectar dichos complejos, cuya presencia es indicativa de infección por HBV.

11. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de las reivindicaciones 1 a 5 y un portador farmacéuticamente aceptable.