Nuevos métodos para construir bibliotecas de paquetes genéticos que presentan de forma colectiva los miembros de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas.

Un método para preparar ácidos nucleicos, comprendiendo el método las etapas de:



(i) amplificar un ácido nucleico usando un cebador complementario de al menos parte de una secuenciasintética localizada en el extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico;

(ii) hacer el ácido nucleico amplificado monocatenario;

(iii) poner en contacto el ácido nucleico monocatenario amplificado con un oligonucleótido monocatenario,siendo el oligonucleótido monocatenario complementario del ácido nucleico monocatenario en una región en la quese desea escisión, en el que el ácido nucleico monocatenario y el oligonucleótido monocatenario se asocian paraformar una región localmente bicatenaria del ácido nucleico monocatenario, en el que la región localmentebicatenaria comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, y

(iv) escindir el ácido nucleico en el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, en el que la escisióncomprende poner en contacto una endonucleasa de restricción con la región localmente bicatenaria, en la que laendonucleasa de restricción es específica del sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, y en el que laescisión elimina todos los nucleótidos 5' no deseados del ácido nucleico;

realizándose las etapas de contacto y escisión a una temperatura entre 45 ºC y 75 ºC, en el que el ácido nucleicomonocatenario y el oligonucleótido monocatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria delácido nucleico monocatenario y en el que la endonucleasa de restricción está activa a la temperatura seleccionadaentre 45 ºC y 75 ºC.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2001/012454.

Solicitante: DYAX CORP..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 55 Network Drive Burlington MA 01803 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: LADNER, ROBERT, C., ROOKEY,Kristin L, HOET,René, COHEN,EDWARD HIRSCH, NASTRI,HORACIO GABRIEL.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/10 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34).
  • C12N15/66 C12N 15/00 […] › Métodos generales para insertar un gen en un vector para formar un vector recombinante, utilizando la escisión y la unión; Utilización de "linkers" no funcionales o de adaptadores, p. ej. "linkers" que contienen la secuencia para una endonucleasa de restricción.
  • C40B40/02 C […] › C40 TECNOLOGIA COMBINATORIA.C40B QUIMICA COMBINATORIA; BIBLIOTECAS, p. ej. QUIMIOTECAS, BIBLIOTECAS IN SILICO. › C40B 40/00 Bibliotecas per se , p. ej. arrays, mezclas. › Bibliotecas contenidas en o exhibidas por microorganismos, p. ej. bacterias o células animales; Bibliotecas contenidas en o exhibidas por vectores, p. ej. plásmidos; Bibliotecas que únicamente contienen microorganismos o vectores.

PDF original: ES-2400302_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Nuevos métodos para construir bibliotecas de paquetes genéticos que presentan de forma colectiva los miembros de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas La presente descripción está relacionada con construcción de bibliotecas de paquetes genéticos que presentan un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas y presentan colectivamente al menos una parte de la diversidad de la familia. En una realización preferida, los polipéptidos presentados son Fab humanos.

Más específicamente, la descripción se refiere a los métodos de escindir ácidos nucleicos monocatenarios en localizaciones seleccionadas, codificando los ácidos nucleicos escindidos, al menos en parte, a los péptidos, polipéptidos o proteínas presentados en los paquetes genéticos de las bibliotecas de la descripción. En una realización preferida, los paquetes genéticos son fagos o fagémidos filamentosos.

La presente descripción está relacionada además con métodos para explorar las bibliotecas de paquetes genéticos que presentan péptidos, polipéptidos y proteínas útiles y a los péptidos, polipéptidos y proteínas identificados por dicha exploración.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Es ahora práctica habitual en la técnica preparar bibliotecas de paquetes genéticos que presentan un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas y presentan colectivamente al menos una parte de la diversidad de la familia. En muchas bibliotecas comunes, los péptidos, polipéptidos o proteínas presentados están relacionados con anticuerpos. Con frecuencia, son Fab o anticuerpos de cadena sencilla. En general, los ADN que codifican miembros de las familias para presentar deben amplificarse antes de que se clonen y se usen para presentar el miembro deseado de la superficie de un paquete genético. Dicha amplificación típicamente hace uso de cebadores directos e inversos.

Tales cebadores pueden ser complementarios de secuencias nativas del ADN para amplificar o complementarios de oligonucleótidos unidos en los extremos 5’ o 3’ de ese ADN. Los cebadores que son complementarios de secuencias nativas del ADN para amplificar tienen la desventaja de que dan preferencia a los miembros de las familias para presentar. Se amplificarán solamente los miembros que contengan una secuencia en el ADN nativo que sea sustancialmente complementaria del cebador. Los que no, estarán ausentes de la familia. Para los miembros que se amplifican, se suprimirá cualquier diversidad dentro de la región del cebador.

Por ejemplo, la patente Europea 368.684 B1, el cebador que se usa está en el extremo 5’ de la región VH de un gen de anticuerpo. Hibrida con una región de secuencia en el ADN nativo que se dice que está “suficientemente bien conservada” dentro de una especie sencilla. Tal cebador tendrá preferencia por los miembros amplificados frente a los que tengan esta región “conservada”. Se extingue cualquier diversidad dentro de esta región.

Se acepta generalmente que los genes de anticuerpos humanos surgen a través de un procedimiento que implica una selección combinatoria de V y J o V, D y J seguido de mutaciones somáticas. Aunque la mayor diversidad se produce en las regiones determinantes de complementariedad (CDR) , también se produce diversidad en las regiones flanqueantes (FR) más conservadas y al menos parte de esta diversidad confiere o potencia la unión específica con antígenos (Ag) .Como consecuencia, las bibliotecas deberían contener tanta diversidad de CDR y FR como sea posible.

Para clonar los ADN amplificados para presentación en un paquete genético de los péptidos, polipéptidos o proteínas que codifican, los ADN deben escindirse, para producir extremos apropiados para ligación con un vector. Dicha escisión generalmente se efectúa usando sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción portados en los cebadores. Cuando los cebadores están en el extremo 5’ de ADN producido a partir de transcripción inversa de ARN, dicha restricción deja regiones no traducidas 5’ deletéreas en el ADN amplificado. Estas regiones interfieren con la expresión de los agentes clonados y por lo tanto con la presentación de los péptidos, polipéptidos y proteínas codificados por ellas.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención está relacionada con las realizaciones como se define en las reivindicaciones.

Es un objeto de la presente descripción proporcionar nuevos métodos para construir bibliotecas de paquetes genéticos que presenten un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas y presenten de forma colectiva al menos una parte de la diversidad de la familia. Estos métodos no tienen preferencia por ADN que contengan secuencias nativas que sean complementarias de los cebadores usados para amplificación. También permiten que cualquier secuencia que pueda ser deletérea para la expresión se elimine del ADN amplificado antes de clonación y presentación.

Es otro objeto de la presente descripción proporcionar un método para escindir secuencias de ácido nucleico monocatenarias en una localización deseada, comprendiendo el método las etapas de:

(i) poner en contacto el ácido nucleico con un oligonucleótido monocatenario, siendo el oligonucleótido

funcionalmente complementario del ácido nucleico en la región en la que se desea escisión e incluyendo una secuencia que con su complemento en el ácido nucleico forma un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción que en la restricción da como resultado escisión del ácido nucleico en la localización deseada; y

(ii) escindir el ácido nucleico solamente en el sitio de reconocimiento formado por la complementación del ácido nucleico y el oligonucleótido;

realizándose las etapas de contacto y escisión a una temperatura suficiente para mantener el ácido nucleico en forma sustancialmente monocatenaria, siendo el oligonucleótido funcionalmente complementario del ácido nucleico sobre una región suficientemente grande para permitir que las dos hebras se asocien de modo que pueda producirse escisión a la temperatura seleccionada y en la localización deseada, y llevándose a cabo la escisión usando una endonucleasa de restricción que es activa a la temperatura seleccionada.

Es un objeto adicional de la presente descripción proporcionar un procedimiento alternativo para escindir secuencias de ácido nucleico monocatenarias en una localización deseada, comprendiendo el método las etapas de:

(i) poner en contacto el ácido nucleico con un oligonucleótido parcialmente bicatenario, siendo la región monocatenaria del oligonucleótido funcionalmente complementaria del ácido nucleico en la región en la que se desea escisión, y la región bicatenaria del oligonucleótido que tiene un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de Tipo II-S, cuyo sitio de escisión se localiza a una distancia conocida del sitio de reconocimiento; y

(ii) escindir el ácido nucleico solamente en el sitio de escisión formado por la complementación del ácido 20 nucleico y la región monocatenaria del oligonucleótido;

realizándose las etapas de contacto y escisión a una temperatura suficiente para mantener el ácido nucleico en forma sustancialmente monocatenaria, siendo el oligonucleótido funcionalmente complementario del ácido nucleico sobre una región suficientemente grande para permitir que las dos hebras se asocien de modo que pueda producirse escisión a la temperatura seleccionada y en la localización deseada, y llevándose a cabo la escisión usando una endonucleasa de restricción que esté activa a la temperatura deseada.

Es otro objetivo de la presente descripción proporcionar un método para capturar moléculas de ADN que comprenden un miembro de una familia diversa de ADN y comprenden colectivamente al menos una parte de la diversidad de la familia. Estas moléculas de ADN en forma monocatenaria se han escindido por uno de los métodos de la presente descripción. Este método implica ligar los miembros de ADN monocatenarios individuales de la familia con un complejo de ADN parcialmente bicatenario. El método comprende las etapas de:

(i) poner en contacto una secuencia de ácido nucleico monocatenaria que se ha escindido con una endonucleasa de restricción con un oligonucleótido parcialmente bicatenario, siendo la región monocatenaria del oligonucleótido funcionalmente complementaria del ácido nucleico en la región que permanece después de la escisión, incluyendo la región bicatenaria del oligonucleótido cualquier secuencia necesaria para devolver las secuencias que permanecen después de la escisión... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para preparar ácidos nucleicos, comprendiendo el método las etapas de:

(i) amplificar un ácido nucleico usando un cebador complementario de al menos parte de una secuencia sintética localizada en el extremo 5’ de la secuencia de ácido nucleico;

(ii) hacer el ácido nucleico amplificado monocatenario;

(iii) poner en contacto el ácido nucleico monocatenario amplificado con un oligonucleótido monocatenario, siendo el oligonucleótido monocatenario complementario del ácido nucleico monocatenario en una región en la que se desea escisión, en el que el ácido nucleico monocatenario y el oligonucleótido monocatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria del ácido nucleico monocatenario, en el que la región localmente bicatenaria comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, y

(iv) escindir el ácido nucleico en el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, en el que la escisión comprende poner en contacto una endonucleasa de restricción con la región localmente bicatenaria, en la que la endonucleasa de restricción es específica del sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, y en el que la escisión elimina todos los nucleótidos 5’ no deseados del ácido nucleico;

realizándose las etapas de contacto y escisión a una temperatura entre 45 ºC y 75 ºC, en el que el ácido nucleico monocatenario y el oligonucleótido monocatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria del ácido nucleico monocatenario y en el que la endonucleasa de restricción está activa a la temperatura seleccionada entre 45 ºC y 75 ºC.

2.Un método para preparar ácidos nucleicos, comprendiendo el método las etapas de:

(i) hacer un ácido nucleico monocatenario;

(ii) poner en contacto la secuencia de ácido nucleico monocatenario con un oligonucleótido monocatenario, siendo el oligonucleótido monocatenario complementario del ácido nucleico monocatenario en una región en la que se desea escisión, en el que el ácido nucleico monocatenario y el oligonucleótido monocatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria del ácido nucleico monocatenario, en el que la región localmente bicatenaria comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción; y

(iii) escindir el ácido nucleico en el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, en el que la escisión comprende poner en contacto una endonucleasa de restricción con la región localmente bicatenaria, en la que la endonucleasa de restricción es específica para el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, y en el que la escisión elimina todos los nucleótidos 5’ no deseados del ácido nucleico;

realizándose las etapas de contacto y escisión a una temperatura entre 45 ºC y 75 ºC en el que el ácido nucleico monocatenario y el oligonucleótido monocatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria del ácido nucleico monocatenario y en el que la endonucleasa de restricción es activa a la temperatura seleccionada entre 45 ºC y 75 ºC.

3.Un método para preparar ácidos nucleicos, comprendiendo el método las etapas de:

(i) amplificar una secuencia de ácido nucleico usando un cebador complementario de al menos parte de una secuencia sintética localizada en el extremos 5’ de la secuencia de ácido nucleico;

(ii) hacer el ácido nucleico amplificado monocatenario;

(iii) poner en contacto el ácido nucleico monocatenario amplificado con un oligonucleótido parcialmente bicatenario, en el que una región monocatenaria del oligonucleótido es complementaria del ácido nucleico en una región en la que se desea escisión y una región bicatenaria del oligonucleótido comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción Tipo II-S, cuyo sitio de escisión se localiza a una distancia conocida del sitio de reconocimiento en el que se desea la escisión del ácido nucleico, en el que el ácido nucleico monocatenario y la región monocatenaria del oligonucleótido parcialmente bicatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria, en la que la región localmente bicatenaria comprende un sitio de escisión de endonucleasa de restricción; y

(iv) escindir el ácido nucleico en el sitio de escisión Tipo II-S en el que la escisión comprende poner en contacto una endonucleasa de restricción con el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción en la región bicatenaria del oligonucleótido, en el que la endonucleasa de restricción es específica del sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción y en el que la escisión elimina todos los nucleótidos 5’ no deseados del ácido nucleico;

realizándose las etapas de contacto y escisión a una temperatura entre 45 ºC y 75 ºC, en el que el ácido nucleico monocatenario y la parte monocatenaria del oligonucleótido parcialmente bicatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria del ácido nucleico monocatenario, y en el que la endonucleasa de restricción es activa a la temperatura seleccionada entre 45 ºC y 75 ºC.

4.Un método para preparar ácidos nucleicos, comprendiendo el método las etapas de:

(i) hacer una secuencia de ácido nucleico monocatenaria;

(ii) poner en contacto el ácido nucleico monocatenario con un oligonucleótido parcialmente bicatenario, en el que una región monocatenaria del oligonucleótido es complementaria del ácido nucleico en una región en la que se desea escisión, y una región bicatenaria del oligonucleótido que tiene un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de Tipo II-S, cuyo sitio de escisión se localiza a una distancia conocida del sitio de reconocimiento en el que se desea la escisión del ácido nucleico, en el que el ácido nucleico monocatenario y la región monocatenaria del oligonucleótido parcialmente bicatenario se asocia para formar una región localmente bicatenaria, en la que la región localmente bicatenaria comprende un sitio de escisión de endonucleasa de restricción; y

(iii) escindir el ácido nucleico en la escisión de Tipo II-S en la que la escisión comprende poner en contacto una endonucleasa de restricción con la región bicatenaria del oligonucleótido, en el que la endonucleasa de restricción es específica para el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, y en el que la escisión elimina todos los nucleótidos 5’ no deseados del ácido nucleico;

realizándose las etapas de contacto y escisión a una temperatura entre 45 ºC y 75 ºC en el que el ácido nucleico monocatenario y el oligonucleótido monocatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria del ácido nucleico monocatenario, y en el que la endonucleasa de restricción es activa a la temperatura seleccionada entre 45 ºC y 75 ºC.

5.Un método para realizar una biblioteca que comprende las siguientes etapas:

(a) preparación de una colección de ácidos nucleicos que codifican al menos en parte miembros de la familia diversa, comprendiendo la preparación las siguientes etapas:

(i) amplificar una recogida de secuencias de ácido nucleico usando un cebador complementario de al menos parte de una secuencia sintética localizada en el extremo 5’ de la secuencia de ácido nucleico;

(ii) hacer los ácidos nucleicos amplificados monocatenarios;

(iii) poner en contacto los ácidos nucleicos monocatenarios amplificados con un oligonucleótido monocatenario, siendo el oligonucleótido monocatenario complementario de los ácidos nucleicos monocatenarios en una región en la que se desea escisión, en la que los ácidos nucleicos monocatenarios y el oligonucleótido monocatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria de los ácidos nucleicos monocatenarios, en la que la región localmente bicatenaria comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, y

(iv) escindir los ácidos nucleicos en el reconocimiento de endonucleasa de restricción, en el que la escisión comprende poner en contacto una endonucleasa de restricción con la región localmente bicatenaria, en la que la endonucleasa de restricción es específica para el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, y en el que la escisión elimina todos los nucleótidos 5’ no deseados de los ácidos nucleicos;

realizándose las etapas de contacto y escisión a una temperatura entre 45 ºC y 75 ºC en el que los ácidos nucleicos monocatenarios y el oligonucleótido monocatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria del ácido nucleico monocatenario, y en el que la endonucleasa de restricción está activa a la temperatura seleccionada entre 45 ºC y 75 ºC; y

(b) expresión de la colección de ácidos nucleicos de la etapa (a) por una colección de paquetes genéticos que presentan un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas y que presentan colectivamente al menos una parte de la familia, en la que los péptidos, polipéptidos o proteínas presentados se codifican al menos en parte por los ácidos nucleicos escindidos en la superficie del paquete genético y presentan colectivamente al menos una parte de la diversidad de la familia.

6.Un método para preparar una biblioteca que comprende las siguientes etapas:

(a) preparación de una colección de ácidos nucleicos que codifican, al menos en parte, miembros de la familia diversa, comprendiendo la preparación las siguientes etapas:

(i) amplificar una colección de secuencias de ácido nucleico usando un cebador complementario de al menos parte de una secuencia sintética localizada en el extremo 5’ de las secuencias de ácido nucleico;

(ii) hacer los ácidos nucleicos amplificados monocatenarios;

(iii) poner en contacto los ácidos nucleicos monocatenarios amplificados con un oligonucleótido parcialmente bicatenario, en el que una región monocatenaria del oligonucleótido es complementaria de los ácidos nucleicos en una región en la que se desea escisión, y una región bicatenaria del oligonucleótido comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de Tipo II-S, cuyo sitio de escisión se localiza a una distancia conocida del sitio de reconocimiento en el que se desea escisión de los ácidos nucleicos, en el que los ácidos nucleicos monocatenarios y la región monocatenaria del oligonucleótido parcialmente bicatenario se asocian para

formar una región localmente bicatenaria, en la que la región localmente bicatenaria comprende un sitio de escisión de endonucleasa de restricción; y

(iv) escindir los ácidos nucleicos en el sitio de escisión de Tipo II-S en el que la escisión comprende poner en contacto una endonucleasa de restricción con el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción en la región bicatenaria del oligonucleótido, en el que la endonucleasa de restricción es específica para el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, y en el que la escisión retira todos los nucleótidos 5’ no deseados de los ácidos nucleicos;

realizándose las etapas de contacto y escisión a una temperatura entre 45 ºC y 75 ºC, en el que los ácidos nucleicos monocatenarios y el oligonucleótido monocatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria de los ácidos nucleicos monocatenarios, y en el que la endonucleasa de restricción está activa a la temperatura seleccionada entre 45 ºC y 75 ºC; y

(b) expresar la colección de ácidos nucleicos de la etapa (a) por una colección de paquetes genéticos que presentan un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas y que presentan colectivamente al menos una parte de la familia, en la que los péptidos, polipéptidos o proteínas presentados se codifican al menos en parte por los ácidos nucleicos escindidos en la superficie del paquete genético y que presentan colectivamente al menos una parte de la diversidad de la familia.

7.El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que los ácidos nucleicos codifican al menos una parte de una inmunoglobulina.

8.El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la inmunoglobulina comprende un Fab o un Fv de cadena sencilla.

9.El método de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que la inmunoglobulina comprende al menos una parte de una cadena pesada.

10.El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que al menos una parte de la cadena pesada es humana.

11.El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que la inmunoglobulina comprende al menos una parte de FR1.

12.El método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que al menos una parte de la FR1 es humana.

13.El método de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que la inmunoglobulina comprende al menos una parte de una cadena ligera.

14.El método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que al menos una parte de la cadena ligera es humana.

15.El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las secuencias de ácido nucleico derivan al menos en parte de pacientes que padecen al menos una enfermedad autoinmune o cáncer.

16.El método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste en lupus eritematoso, esclerosis sistémica, artritis reumatoide, síndrome antifosfolipídico o vasculitis.

17.El método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que los ácidos nucleicos se aíslan al menos en parte del grupo que comprende células de sangre periférica, células de médula ósea, células del bazo o células de ganglios linfáticos.

18.El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la temperatura está entre 55 ºC y 60 ºC.

19.El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 5, en el que la longitud del oligonucleótido monocatenario está entre 17 y 30 bases.

20.El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 5, en el que la endonucleasa de restricción se selecciona del grupo que comprende: Maelll, Tsp451, Hphl, BsaJI, Alul, Dlpl, Ddel, Bglll, MslI, BsiEl, Eael, Eagl, Haelll, Bst4CI, HpyCH4IIl, Hinfl, Mlyl, Plel, MalI, HpyCH4V, Bsm AI, Bpml, Xmnl, o SacI.

21.El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 y 6, en el que la longitud de la región monocatenaria del oligonucleótido parcialmente bicatenario está entre 14 y 22 bases.

22.El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 y 6, en el que la longitud de la parte bicatenaria del oligonucleótido parcialmente bicatenario está entre 10 y 14 pares de bases formados por un tallo y su palíndromo.

23.El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 y 6, en el que la endonucleasa de restricción de Tipo II-S se selecciona del grupo que comprende AarlCAC, Acelll, Bbr7I, Bbvl, BbvII, Bce83I, BceAI, Bcefl, BciVI, Bfil, BinI, BscAI, BseRI, BsmFI, BspMI, Ecil, Eco57I, Raul, Fokl, Gsul, Hgal, Hphl, MboII, Mlyl, Mmel,

Mnli, Plel, RleAI, SfaNI, SspD5I, Sthl32I, StsI, Taqll, Tthl 1 HI, o UbaPI.

Tabla 1: Escisión de 75 cadenas ligeras humanas

* La escisión se produce en la hebra superior después de la última base en mayúsculas. Para ER que cortan secuencias palidrómicas, la hebra inferior se corta en el sitio simétrico.

Tabla 2: Escisión de 79 cadenas pesadas humanas

Tabla 5: Uso de Fokl como una "enzima de restricción universal"

Tabla 8: Coincidencias con adaptadores de FR3 de ERU en 79 HC humanas A. Lista de genes de cadenas pesadas de los que se han tomado muestras Tabla 8B. Ensayo de todos los GLG distintos de bases 89.1 a 93.2 del dominio variable pesado

Tabla 8C Secuencias de reconocimiento de ERU más importantes en FR3 pesada

Tabla 8D, ensayo de 79 genes de V HC humanos con cuatro sondas Número de secuencias ……………………….79 Nümero de bases…………………………..29143

Número de emparejamiento erróneos

Una secuencia tiene cinco emparejamientos erróneos con secuencias 2, 4 y 9; se puntuó como mejor para 2.

Id es el número de adaptador.

Mejor es el número de secuencia para el que el adaptador identificado era el mejor disponible.

El resto de la tabla muestra lo bien que las secuencias coinciden con los adaptadores. Por ejemplo, hay 11 secuencias que coinciden con VHSzy1 (Id=1) con 2 emparejamientos erróneos y son peores para todos los demás adaptadores. En esta muestra, 90% quedan a una distancia de dos bases de uno de los cuatro adaptadores.

Tabla 130: Cebadores de PCR para amplificación de genes Ab humanos Tabla 195: Secuencias FR3 GLG humanas

Tabla 250: Adaptadores de ER, prolongadores y puentes usados para escisión y captura de cadenas pesadas humanas en FR3.

A: Sondas de HpyCH4V de genes HC humanos reales !HpyCH4V en FR3 de HC humana, base.

3. 56; solo los que tienes sitio TGca TGca;10 reconocimiento de ER: tgca de longitud 4 se espera en 10

B: HpyCH4V adaptadores de ER, prolongadores y puentes

B.1. Adaptadores de ER

! Corte hebra inferior HC: ! TmKeller para NaCl 100 mM, formamida cero

B.2 Segmento de gen 3-23 sintético en el que debe clonarse CDR3 capturada

B.3 Prolongador y puentes ! Prolongador (hebra inferior)

! Puentes (hebra superior, solapamiento de 9 bases) :

C. Sondas de BlpI de GLG HC humanos D: BlpI adaptadores de ER, extensores y puentes D.1. Adaptadores de ER

D.2 Segmento de gen 3-23 sintético en el que debe clonarse CDR3 capturada

D.3 Prolongador y puentes ! Puentes ! Prolongador

E. HpyCH4III Secuencias GLG distintas que rodean el sitio, base.

7. 98

F. HpyCH4III adaptadores de ER, prolongadores y puentes F. 1. Adaptadores de ER

! ON para escisión de HC (inferior) en FR3 (base.

7. 97) ! Para escisión con HpyCH4III, Bst4CI o TaaI ! La escisión es en la cadena inferior antes de la base 88.

F.2 Prolongador y puentes ! Se añaden sitios XbaI y AflIII en puentes ! Se añaden sitios XbaI y AflIII en puentes

Tabla 510

Tabla 600: Armazón VH V3-23 con codones abigarrados mostrados

Tabla 800 (nueva) La siguiente lista de enzimas se tomó de http://rebase.neb.com/cgi-bin/asymmlist. Se han eliminado las enzimas que a) cortan dentro del reconocimiento, b) cortan en ambos lados del reconocimiento

o c) tienen menos de 2 bases entre el sitio de reconocimiento y el sitio de corte más cercano. Enzimas REBASE 13/04/2001 Enzimas de restricción de tipo II con secuencias de reconocimiento asimétricas

La anotación es ^ significa corte de la hebra superior y _ corte de la hebra inferior. Si la hebra superior e inferior se cortan en el mismo lugar, entonces solamente aparece ^.

Tabla 120: MALIA3, anotada

! De BstEII en adelante, pV323 es igual que pCES1, excepto como se observa. ! Los sitios BstEII pueden aparecer en cadenas ligeras; probablemente no sean únicos en el ! vector final.

AUSENTE EN EL MOMENTO DE PUBLICACIÓN

Tabla 120B: Secuencia de MALIA3, condensada Tabla 200: Enzimas que cortan 15 o más GLG humanos o tienen reconocimiento de +5 bases en FR3 Entrada típica: Reconocimiento de nombre de ER #sitios Tabla 206: FR3 3-23 sintética de cadenas pesadas humanas que muestran posiciones de posibles sitios de escisión ! Los sitios introducidos por ingeniería genética en el gen sintético se muestran en ADN en ! mayúsculas con el nombre de la ER entre barras verticales (como en ∀ XbaI ∀) ! Las RER frecuentemente halladas en GLG se muestran debajo de la secuencia sintética ! con el nombre a la derecha (como en gtn ac = MaeIII (24) , que indica que ! 24 de los 51 GLG contiene el sitio) .

Tabla 217: Secuencias FR1 de GLG HC humanas Exón VH - Alineamientos de secuencias de nucleótidos Tabla 220: Sitios SRER en FR1 de GLG HC humanas en las que hay al menos 20 GLG cortados Tabla 255: Análisis de frecuencia de adaptadores de ER coincidentes en genes V reales

HpyCH4V en HC en las base.

3. 56 A: Secuencias con el sitio ER esperado solamente ………………..1004

(Se cuentan solamente casos con 4 o menos emparejamientos erróneos) Secuencias con solamente un sitio inesperado …………………...…0Secuencias con tanto esperados como inesperados ………………48

(Se cuentan solamente casos con 4 o menos emparejamientos erróneos) Secuencias sin sitios …………………………………………………….0

Secuencias con el sitio ER esperado solamente ………….. 597 (contando secuencias con 4 o menos emparejamiento erróneos) Secuencias con solamente un sitio inesperado……………….2Secuencias con tanto esperados como inesperados…………2Secuencias sin sitios…………………………………………..686

HpyCH4III, Bst4CI o Taal en HCC:

En la puntuación de si está presente el sitio ER de interés solo se cuentan ON que tengan 4 o menos emparejamientos erróneosNúmero de secuencias ………………………1617

Secuencias con el sitio ER esperado solamente ………….1511 Secuencias con solamente un sitio inesperado………………..0

Tabla 255B Secuencias con tanto esperadas como inesperadas …..8 Secuencias sin sitios……………………………………………0 Análisis repetido usando solamente los 8 mejores adaptadores de ER

Secuencias con el sitio ER esperado solamente ………….. 1463/1617 Secuencias con solamente un sitio inesperado………………….0 Secuencias con tanto esperados como inesperados …………..7 Secuencias sin sitios ……………………………………………….0

Tabla 300: GLG FR1 kappa Tabla 302: Sitios SRER hallados en GLG FR1 kappa humanos, continuación AUSENTE EN EL MOMENTO DE PUBLICACIÓN

Tabla 500: h3401-h2 capturado mediante CJ con BsmAI Tabla 501: H3401-d8 KAPPA capturado con CJ y BsmAI

Tabla 508: Bases de cadenas pesadas humanas 88.1 a 94.2Número de secuencias ……….840

Tabla 512: Kappa, bases 12-30

Tabla 512: Kappa, bases 12-30

Tabla 515: Bases de adaptadores de ERU lambda 13.3 a 19.3! Número de secuencias ………………..128!

Lo que sucede en la hebra superior

Tabla 525 ON usados en la captura de cadenas ligeras kappa usando método CJ y BsmAI Todos los ON se escriben en 5' a 3'

Adaptadores de ER (6)

Puentes (6)

Prolongador (biotinilado 5')

Cebadores

Tabla 530Programa de PCR para amplificación de ADN kappa95ºC 5 minutos 95ºC 15 segundos 65ºC 30 segundos 72ºC 1 minuto 72ºC 17 minutos 4ºC mantenimiento

Reactivos (reacciones 100 !l)

Molde 50 ng Tampón de PCr turbo 10x 1x turbo Pfu 4U dNTP 200 !M cada uno kaPCRt1 300 nM kapfor 300 nM

Tabla 620: Secuencia de ADN de pCES5! 6680 bases de pCES5 = pCes4 con rellenos en CDR1-2 y CDR3 13.12.2000!! Ngen = 6680! ER útiles (cortan MAnoLI menos de 3 veces) 05.06.2000

Tabla 630: Oligonucleótidos usados para clonar diversidad de CDR1/2Todas las secuencias son 5' a 3'

Final de tablas


 

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