Nuevos elementos reguladores.

Una señal de poliadenilación que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia que es idéntica al menos en un 75 % a la SEQ ID NO:8.

Nuevos elementos reguladores Antecedentes de la invención

Campo técnico

La invención se refiere al campo de la tecnología del cultivo celular. Se refiere a nuevos elementos reguladores así como a un método para mejorar la expresión de polipéptidos a partir de ácidos nucleicos tales como genes clonados y a la producción de varios polipéptidos en una célula hospedante eucariota utilizando dichos nuevos elementos reguladores.

Antecedentes El mercado de los compuestos biofarmacéuticos para uso en terapia humana continúa creciendo a gran velocidad con más de 900 compuestos biofarmacéuticos evaluados en estudios clínicos y unas ventas estimadas de 50.000 millones en 2010. Actualmente, se produce un número creciente de compuestos biofarmacéuticos a partir de células de mamífero debido a la capacidad de éstas para producir y modificar correctamente las proteínas humanas. Por lo tanto las proteínas recombinantes son compatibles con los seres humanos tanto funcional como farmacocinéticamente. Una deficiencia en comparación con los sistemas de expresión procarióticos es a menudo el nivel de expresión de proteínas significativamente más bajo. La producción satisfactoria y con alto rendimiento de compuestos biofarmacéuticos a partir de células de mamífero es por lo tanto crucial y está determinada por diferentes factores incluyendo la línea de la célula hospedante, el sistema de expresión, el crecimiento y la productividad celular, los medios de cultivo y de alimentación, el procedimiento de producción y purificación, la estructura y secuencia de la proteína, la estabilidad y formulación de la proteína.

La expresión de la proteína recombinante requiere un vector de expresión que codifica el gen de interés deseado. Se han empleado varios métodos para optimizar los vectores de expresión para una producción eficiente de proteína. La expresión génica se regula a niveles de transcripción y de traducción. Por lo tanto muchos métodos se refieren a la identificación y optimización de promotores y potenciadores fuertes para mejorar la eficiencia con la que se transcriben los genes que codifican la proteína. Ejemplos de ellos son el promotor y potenciador temprano inmediato de CMV (citomegalovirus) , el promotor y potenciador de SV40 (virus de simio 40) , el promotor del factor de elongación (EF) , el potenciador de polioma, y el promotor de [beta]-actina de pollo. Asimismo, se utilizan también las secuencias de señales de poliadenilación fuertes que estabilizan los ARNm y potencian la terminación de la transcripción, para aumentar la expresión de la proteína a partir de genes codificados por los vectores de expresión. Entre los métodos para mejorar la eficiencia con la que se traduce el ARNm resultante están el uso de los sitios de iniciación de la traducción (AUG) , los sitios de unión óptima al ribosoma tales como la secuencia de Kozak (GCCGCCACCAUGG; AUG constituye el codón de inicio) o los sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) .

Uno de los métodos empleados para optimizar los vectores de expresión con el fin de obtener niveles más altos de expresión de genes recombinantes en células eucariotas se refiere al uso y selección de las señales de poliadenilación. Se utilizan una variedad de señales de poliadenilación en los vectores para la expresión de proteínas recombinantes. Las más comúnmente usadas incluyen por ejemplo las señales de poliadenilación procedentes de la hormona de crecimiento bovina (BGH) (documentos US 5.122.458; EP 0173552) , región tardía y temprana del virus de simio 40, beta-globina de conejo, inmunoglobulinas humanas o de ratón, región tardía de virus polioma.

En el ARN mensajero (ARNm) de eucariotas la región 3′ no traducida (3′UTR) es un elemento regulador importante. En muchos casos dicta la estabilidad del ARNm y puede regular también la eficiencia de la traducción. Las señales de poliadenilación son secuencias de nucleótidos dentro de la 3′UTR que dirigen la unión de un complejo de proteína de poliadenilación con una secuencia AAUAAA dentro de la secuencia señal. El complejo contiene una endonucleasa que corta el ARNm aproximadamente 14 a 30 nucleótidos corriente abajo de la secuencia AAUAAA y una polimerasa que incorpora post-transcripcionalmente una cadena de aproximadamente 100 a 200 nucleótidos de adenina (cola poliA) al extremo 3′ escindido. Se cree que la cola poliA influye en muchos aspectos del metabolismo de ARNm, incluyendo la estabilidad, la eficiencia de la traducción, y el transporte desde el núcleo al citoplasma. Típicamente, la señal de poliadenilación consiste en dos elementos de reconocimiento que flanquean el sitio de escisión y poliadenilación: una secuencia AAUAAA altamente conservada de aproximadamente 14 a 30 nucleótidos corriente arriba del sitio de escisión y una región rica en G/U o en U pobremente conservada de aproximadamente 20 a 50 nucleótidos corriente abajo de la secuencia AAUAAA. La escisión entre estos dos elementos se efectúa usualmente en el lado 3′ de un residuo A. La eficiencia con la que se procesan diferentes sitios de poliadenilación varía considerablemente in vivo. La velocidad de ensamblaje del complejo de la proteína de poliadenilación es un proceso en multietapas y guarda correlación con la resistencia de la secuencia de la señal de poliadenilación. Por

ejemplo, debido a la velocidad más rápida de ensamblaje, la escisión en la señal de poliadenilación tardía fuerte de SV40 tiene lugar más rápidamente que en la señal de poliadenilación temprana más débil de SV40 (Chao et al., Molecular and Cellular Biology, Vol. 19 (8) , 5588-5600, 1999) .

Existe la necesidad de identificar señales alternativas de poliadenilación fuertes o incluso muy fuertes para acelerar la generación de líneas celulares altamente productoras para la producción de proteínas recombinantes. El uso de señales de poliadenilación fuertes o incluso muy fuertes mejora la terminación de la transcripción que a su vez da como resultado un aumento de la producción, estabilidad, exportación nuclear y/o traducción del ARNm codificado por el vector. Esto debería llevar a niveles más altos de ARNm y por lo tanto ocasionar una productividad más alta de las células productoras.

Compendio de la invención/Solución Se describe aquí una nueva señal de poliadenilación aislada de la hormona de crecimiento del hámster chino (Cricetus griseus) . Sorprendentemente, se ha encontrado que esta señal de poliadenilación recién identificada, denominada HGH, aventaja a las señales fuertes de poliadenilación BGH y SV40 tardía. Cuando se utilizan vectores que comprenden HGH como secuencia de la señal de poliadenilación, los títulos de proteína en las transfecciones transitorias de las células CHO-DG44 aumentaron hasta un 35 % en comparación con las células que comprenden BGH. En células estables se obtuvieron altas productividades específicas de hasta 45 pg/célula/día y títulos en los procesos de lote alimentado de hasta 6, 3 g/L.

Una realización de la presente invención es una secuencia de polinucleótidos que comprende al menos una señal de poliadenilación HGH y al menos una secuencia de nucleótidos heterólogos que codifica un producto de interés. La señal de poliadenilación HGH está corriente abajo y está ligada operativamente a la secuencia o secuencias de nucleótidos heterólogos. Otra realización de la presente invención es un nuevo vector que comprende al menos una secuencia de nucleótidos heterólogos que codifica un producto de interés y al menos una señal de poliadenilación HGH. La señal de poliadenilación HGH está corriente abajo y está ligada operativamente a la secuencia o secuencias de nucleótidos heterólogos. Otra realización de la presente invención es un nuevo vector o secuencia de polinucleótidos que comprende al menos una señal de poliadenilación HGH ligada operativamente a un sitio de clonación múltiple corriente arriba que permite la clonación del gen de interés mediante secuencias de reconocimiento de las endonucleasas de restricción. Otra realización más de la presente invención es una célula eucariota, preferiblemente una célula de mamífero, que comprende la señal de poliadenilación HGH. Todavía una realización más de la presente invención es un método para producir un producto de interés que comprende cultivar células eucariotas, preferiblemente células de mamífero transfectadas con vectores o secuencias de polinucleótidos que comprenden la señal de poliadenilación HGH. En una realización preferida el producto de interés es un polipéptido y el polipéptido deseado se recupera del medio de cultivo.

Los datos de la presente invención muestran el impacto... [Seguir leyendo]

1. Una señal de poliadenilación que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia que es idéntica al menos en un 75 % a la SEQ ID NO:8.

2. La señal de poliadenilación según la reivindicación 1, que comprende una secuencia idéntica al menos en un 80 5 %, 85 %, 90 %, 95 % o 98 % a la SEQ ID NO:8.

3. La señal de poliadenilación según las reivindicaciones 1 o 2, que comprende la SEQ ID NO:8.

4. La señal de poliadenilación según las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha señal de poliadenilación está ligada operativamente a una secuencia de codificación heteróloga.

5. Un vector que comprende una cualquiera de dichas señales de poliadenilación de las reivindicaciones 1 a 4.

6. El vector de la reivindicación 5, que comprende un gen heterólogo de interés que codifica un producto heterólogo de interés.

7. El vector de la reivindicación 6, en donde el producto de interés es un polipéptido de interés y dicho polipéptido de interés es un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o proteína de fusión.

8. Una célula que comprende el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.

9. La célula según la reivindicación 8, en donde la señal de poliadenilación de las reivindicaciones 1 a 4, está ligada operativamente a una unidad de transcripción que codifica un producto de interés y en donde el producto de interés es un polipéptido de interés codificado por un gen de interés.

10. La célula según las reivindicaciones 8 o 9, en donde dicha célula es una célula de hámster.

11. La célula según la reivindicación 10, en donde la célula de hámster es una célula de ovario de hámster chino 20 (CHO) , preferiblemente una célula CHO DG44.

12. Un método para preparar un polipéptido de interés codificado por un gen de interés, comprendiendo el método:

(a) Proporcionar una célula hospedante que comprende un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, o proporcionar una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10

(b) Cultivar dicha célula, en condiciones que permitan la proliferación de la célula y la expresión del gen de interés, 25 (c) Recoger el polipéptido de interés y

(d) Purificar el polipéptido de interés.

13. El uso de una cualquiera de las señales de poliadenilación de las reivindicaciones 1 a 4, como un aislante.

14. Un kit que comprende una cualquiera de las señales de poliadenilación de las reivindicaciones 1 a 4, un vector, una célula y un medio de cultivo celular para cultivo de dicha célula.

FIGURA 1

FIGURA 2

FIGURA 3

FIGURA 4

FIGURA 5

FIGURA 6

Vector Secuencia de terminación Transfección transitoria # 1 (n= 2) Transfección transitoria # 2 (n= 2)

pJR106 SV40 tardía (SEQ ID NO: 11) 193 ng/mL sICAM 207 ng/mL sICAM

pJR110 BGH (SEQ ID NO: 12) 222 ng/mL sICAM 234 ng/mL sICAM

pJR131 HGH (SEQ ID NO: 8) 269 ng/mL sICAM 257 ng/mL sICAM

FIGURA 7

Combinación de vectores Secuencia de terminación Transfección transitoria (n= 6)

pBID-B/IgG4 + pBIN-B/kappa BGH (SEQ ID NO: 12) 40 ± 6 ng/mL IgG4

pBID-B/IgG4 + pBIN-B/kappa HGH (SEQ ID NO: 8) 54 ± 8 ng/mL IgG4

FIGURA 8

Vector Secuencia de HGH (3’UTR) Transfección transitoria # 1 (n= 2) Transfección transitoria # 2 (n= 2)

pJR131 bp 1 - 324 (SEQ ID NO: 8) 111 ng/mL sICAM 108 ng/mL sICAM

pJR134 bp 1 - 189 (SEQ ID NO: 9) 98 ng/mL sICAM 83 ng/mL sICAM

pJR135 bp 1 - 113 (SEQ ID NO: 10) 25 ng/mL sICAM 25 ng/mL sICAM

FIGURA 9

Producto Clones de células/ Conjunto de células Productividad específica (pg/célula/día) Título en proceso de lote alimentado

IgG1 (1) clones de células 23 6, 3 g/L (biorreactor de 40 L)

IgG1 (2) conjunto de células (MTX 800 mM) 32 2, 5 g/L (frasco de agitación)

IgG2 clones de células 10 2, 1 g/L (biorreactor de 2 L)

IgG4 conjunto de células (MTX 800 mM) 44 2, 1 g/L (frasco de agitación)

Proteína de fusión Fc (IgG1) conjunto de células (MTX 800 mM) 45 3, 9 g/L (frasco de agitación)

Proteína de fusión Fc (IgG2) conjunto de células (MTX 800 mM) 34 3, 4 g/L (frasco de agitación)