Procedimiento para la optimización de procedimientos de cromatografía de purificación para biomoléculas.

Procedimiento para hallar parámetros adecuados para procedimientos de cromatografía para la separación de biomoléculas,

llevándose a cabo, con variación de parámetros individuales, ensayos con material de cromatografía que incluyen una secuencia de etapas de etapas de equilibrado, carga, lavado y elución y deduciéndose parámetros óptimos a partir de los resultados de estos ensayos, empleándose el material de cromatografía por enfoque en una cantidad para que el lecho de gel obtenido con ello presente un volumen entre 0, 01 ml y 2 ml, en el que

(a) una puesta en suspensión de un material de cromatografía se pone en múltiples cavidades de una placa de 10 filtro multipocillo,

(b) en las cavidades provistas de la puesta en suspensión se genera un lecho de gel húmedo al retirarse el sobrenadante sobre el material de cromatografía mediante centrifugación o mediante aplicación de una diferencia de presión,

(c) para el equilibrado del material de cromatografía que se encuentra en las cavidades se añade al lecho de gel 15 húmedo una solución de tampón de equilibrado y el lecho de gel se pone en suspensión (etapa de equilibrado),

(d) correspondientemente a la etapa (b) se genera un lecho de gel húmedo,

(e) opcionalmente, las etapas (c) y (d) se repiten varias veces, en particular una vez, dos veces o tres veces,

(f) para la carga del material de cromatografía se añade al lecho de gel una solución de ensayo que contiene al

menos una biomolécula y se pone en suspensión el lecho de gel (etapa de carga), 20 (g) correspondientemente a la etapa (b) se genera un lecho de gel húmedo,

(h) para el lavado del material de cromatografía se añade al lecho de gel una solución de lavado, poniéndose opcionalmente en suspensión el lecho de gel (etapa de lavado),

(i) correspondientemente a la etapa (b) se genera un lecho de gel húmedo,

(k) opcionalmente, las etapas (h) e (i) se repiten varias veces, en particular una vez, dos veces o tres veces,

pudiendo presentar las soluciones de lavado usadas composiciones iguales o diferentes y poniéndose en suspensión o no poniéndose en suspensión opcionalmente el lecho de gel,

(l) para la elución de la biomolécula se añade al lecho de gel una solución de elución sin causar una puesta en suspensión del lecho de gel (etapa de elución),

(m) correspondientemente a la etapa (b) se genera un lecho de gel húmedo y en este caso se recoge el eluato,

(n) opcionalmente, las etapas (I) y (m) se repiten varias veces, en particular una vez, dos veces o tres veces, pudiendo presentar las soluciones de elución usadas composiciones iguales o diferentes y

(o) los eluatos recogidos se analizan.

Procedimiento para la optimización de procedimientos de cromatografía de purificación para biomoléculas La invención se refiere a un procedimiento que posibilita el desarrollo y la optimización de procedimientos de cromatografía de purificación para biomoléculas que se pueden llevar a cabo a gran escala.

Antecedentes de la invención Las biomoléculas tales como proteínas, polinucleótidos, polisacáridos y similares están obteniendo cada vez más importancia comercial como medicamentos, como medios de diagnóstico, como aditivos en alimentos, detergentes y similares, como reactivos de investigación y para muchas otras aplicaciones. La necesidad de tales biomoléculas por norma general spor ejemplo, en el caso de proteínass ya no se puede satisfacer mediante el aislamiento de las moléculas de fuentes naturales, sino que requiere el empleo de métodos de producción biotecnológica.

La producción biotecnológica de proteínas comienza típicamente con el aislamiento del ADN que codifica la proteína deseada y su clonación en un vector de expresión adecuado. Después de la introducción mediante transfección del vector de expresión en células de expresión procariotas o eucariotas adecuadas y posterior selección de las células transfectadas, las últimas se cultivan en fermentadores y se expresa la proteína deseada. A continuación se produce la recuperación de las células o del sobrenadante del cultivo y el tratamiento y la purificación de la proteína allí contenida.

En el caso de sistemas de expresión eucariotas, es decir, en caso del uso de cultivos de células de mamífero tales como, por ejemplo, células CHO o NS0, en los últimos 15 años se ha podido conseguir un aumento en un factor de 100 de la concentración obtenible en la etapa de expresión de la proteína deseada en los cultivos celulares o en los sobrenadantes de cultivo celular. En el mismo periodo de tiempo aumentó la capacidad de unión de materiales de cromatografía que se emplean en la posterior purificación de las proteínas tan solo un factor de 3. Por este motivo existe una urgente necesidad de procedimientos de purificación optimizados, mejorados, para biomoléculas, en particular para proteínas, que se puedan llevar a cabo a gran escala industrial.

En el caso de los productos biofarmacéuticos, tales como, por ejemplo, proteínas empleadas como medicamentos, por ejemplo, anticuerpos terapéuticos, además del rendimiento del producto también tiene una importancia destacada la separación de impurezas. En este caso se puede diferenciar entre impurezas dependientes del proceso y del producto. Las impurezas dependientes del proceso incluyen componentes de las células hospedadoras, tales como proteínas y ácidos nucleicos, y proceden del cultivo celular (tales como constituyentes de medios) o del tratamiento (tales como, por ejemplo, sales o ligandos de cromatografía separados) . Las impurezas dependientes del producto son variantes moleculares del producto con propiedades diferentes. A esto pertenecen formas acortadas, tales como precursores y productos de degradación hidrolítica, sin embargo también formas modificadas, producidas, por ejemplo, mediante desaminaciones, falsas glucosilaciones o puentes disulfuro enlazados incorrectamente. A las variantes dependientes del producto también pertenecen los polímeros y agregados. Se denominan contaminantes todos los demás materiales de naturaleza química, bioquímica o microbiológica que no pertenecen directamente al proceso de producción. Son contaminantes, por ejemplo, los virus que pueden aparecer, de manera indeseada, en cultivos celulares.

Las impurezas y los contaminantes conducen en el caso de los productos biofarmacéuticos a reparos en cuanto a la seguridad. Estos se intensifican cuando scomo muy frecuentemente en el caso de los productos biofarmacéuticoss la administración de las proteínas terapéuticas se realiza a través de inyección o infusión directamente al torrente sanguíneo. De este modo, los componentes de la célula hospedadora pueden conducir a reacciones alérgicas o efectos inmunopatológicos. Además, las impurezas pueden llevar también a una inmunogenicidad indeseada de la proteína administrada, es decir, desencadenar una reacción inmunitaria indeseada del paciente al producto terapéutico, hasta un choque anafiláctico con riesgo para la vida. Por tanto, existe una necesidad de procesos adecuados de purificación con los que se pueda efectuar un empobrecimiento de todas las sustancias indeseadas hasta un grado inocuo.

Por otro lado, tampoco se pueden ignorar aspectos económicos en el caso de los productos biofarmacéuticos. De este modo, los procedimientos empleados de producción y purificación no deben poner en riesgo la rentabilidad del producto biofarmacéutico generado con los mismos. Además también desempeña un papel considerable el tiempo en el que se ha de establecer un nuevo proceso de purificación: además de la influencia sobre los costes, el desarrollo del proceso tiene que estar ajustado al desarrollo preclínico y clínico del medicamento. De este modo, por ejemplo, determinados estudios preclínicos, y todos los clínicos, no pueden comenzar hasta que estén disponibles cantidades suficientes del producto biofarmacéutico en una pureza suficiente.

Como punto de partida para el desarrollo de un proceso de purificación que se puede llevar a cabo también a gran escala para un anticuerpo puede servir, por ejemplo, el siguiente proceso convencional, consistente en cuatro 65 etapas básicas: en la primera etapa se aísla la proteína diana, se concentra y estabiliza ("captura") . En la segunda etapa se retiran los virus, en la tercera se realiza una purificación en la que se efectúa el empobrecimiento de la mayoría de las impurezas, tales como ácidos nucleicos, otras proteínas y endotoxinas. En la última etapa se eliminan las trazas, dado el caso todavía remanentes, de impurezas y contaminantes ("refinado") .

Además de las etapas de filtración y precipitación, a este respecto, los procedimientos de cromatografía (en columna) adquieren una importancia muy alta. De este modo, por ejemplo, la "captura" incluye frecuentemente una etapa de purificación mediante cromatografía de afinidad. Por consiguiente, actualmente son conocidos numerosos procedimientos de cromatografía en columna y materiales de cromatografía que se pueden usar para ello. No obstante, con un número creciente de alternativas se tienen que llevar a cabo también ensayos previos cada vez más numerosos para establecer los materiales y procedimientos óptimos en cuanto al efecto de purificación, rendimiento, actividad biológica, tiempo, costes, etc.

Durante el establecimiento y la optimización de un proceso de purificación además se tiene que tener en cuenta que el mismo tiene que estar hecho a medida, de manera muy individual, en cuanto a las propiedades bioquímicas y

biofísicas de la molécula respectivamente a purificar (molécula diana, proteína diana) así como en cuanto a las condiciones en las que se ha obtenido el material biológico de partida. El material biológico de partida del cual se ha de aislar la molécula diana por norma general está compuesto de una mezcla muy compleja de sustancias. Para el aislamiento y la concentración de la molécula diana se aprovechan sus respectivas propiedades específicas tales como, por ejemplo, forma, tamaño, solubilidad, carga superficial, hidrofobia superficial así como su afinidad bioespecífica por equivalentes de unión. Para cada nueva molécula diana, de hecho incluso con la misma molécula diana, pero con una variación de una de las etapas de trabajo precedentes (por ejemplo, un cambio de la composición del medio de cultivo para la fermentación) , se tiene que optimizar de nuevo el proceso, ya que en las nuevas condiciones posiblemente ya no se puedan conseguir los mejores resultados posibles desde el punto de vista que se ha mencionado anteriormente.

Al mismo tiempo, gracias a la cantidad de los parámetros que se han mencionado anteriormente se potencia el número de alternativas teóricamente concebibles del proceso. En el caso de la cromatografía en columna se tienen que optimizar, por ejemplo, la disposición de la etapa de cromatografía en todo el proceso, el material de la columna, el valor de pH, el contenido de sal y el tipo de los distintos tampones de elución, la concentración de proteína al cargar la columna y muchas cosas más. Esto hace que sea prácticamente imposible desarrollar a gran escala, con una complejidad razonable de costes y tiempo, un proceso optimizado de cromatografía en columna. Por otro lado, la rentabilidad, pero también las limitaciones en cuanto a la técnica de la instalación (tales como, por ejemplo, la necesidad de emplear... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para hallar parámetros adecuados para procedimientos de cromatografía para la separación de biomoléculas, llevándose a cabo, con variación de parámetros individuales, ensayos con material de cromatografía que incluyen una secuencia de etapas de etapas de equilibrado, carga, lavado y elución y deduciéndose parámetros óptimos a partir de los resultados de estos ensayos, empleándose el material de cromatografía por enfoque en una cantidad para que el lecho de gel obtenido con ello presente un volumen entre 0, 01 ml y 2 ml, en el que

(a) una puesta en suspensión de un material de cromatografía se pone en múltiples cavidades de una placa de 10 filtro multipocillo,

(b) en las cavidades provistas de la puesta en suspensión se genera un lecho de gel húmedo al retirarse el sobrenadante sobre el material de cromatografía mediante centrifugación o mediante aplicación de una diferencia de presión,

(c) para el equilibrado del material de cromatografía que se encuentra en las cavidades se añade al lecho de gel 15 húmedo una solución de tampón de equilibrado y el lecho de gel se pone en suspensión (etapa de equilibrado) ,

(d) correspondientemente a la etapa (b) se genera un lecho de gel húmedo,

(e) opcionalmente, las etapas (c) y (d) se repiten varias veces, en particular una vez, dos veces o tres veces,

(f) para la carga del material de cromatografía se añade al lecho de gel una solución de ensayo que contiene al

menos una biomolécula y se pone en suspensión el lecho de gel (etapa de carga) , 20 (g) correspondientemente a la etapa (b) se genera un lecho de gel húmedo,

(h) para el lavado del material de cromatografía se añade al lecho de gel una solución de lavado, poniéndose opcionalmente en suspensión el lecho de gel (etapa de lavado) ,

(i) correspondientemente a la etapa (b) se genera un lecho de gel húmedo,

(k) opcionalmente, las etapas (h) e (i) se repiten varias veces, en particular una vez, dos veces o tres veces,

pudiendo presentar las soluciones de lavado usadas composiciones iguales o diferentes y poniéndose en suspensión o no poniéndose en suspensión opcionalmente el lecho de gel,

(l) para la elución de la biomolécula se añade al lecho de gel una solución de elución sin causar una puesta en suspensión del lecho de gel (etapa de elución) ,

(m) correspondientemente a la etapa (b) se genera un lecho de gel húmedo y en este caso se recoge el eluato,

(n) opcionalmente, las etapas (I) y (m) se repiten varias veces, en particular una vez, dos veces o tres veces, pudiendo presentar las soluciones de elución usadas composiciones iguales o diferentes y

(o) los eluatos recogidos se analizan.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se llevan a cabo las etapas de equilibrado, carga,

lavado y elución en varios enfoques paralelos, diferenciándose las condiciones de cromatografía al menos en dos de los enfoques y deduciéndose, mediante comparación de los resultados de la cromatografía de los respectivos enfoques, condiciones ventajosas de cromatografía.

3. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 o 2, en el que se llevan a cabo una o varias etapas 40 mediante el uso de un robot de pipeteado.

4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se emplea como material de cromatografía un material para la cromatografía de intercambio iónico, de interacción hidrófoba, de afinidad, de hidroxiapatita, de fase inversa, de inducción de carga hidrófoba o de modo mixto.

5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que se realiza la puesta en suspensión mediante agitación del material de cromatografía o de la placa de filtro multipocillo o mediante el pipeteado hacia arriba y abajo del material de cromatografía.

6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, siendo la biomolécula una proteína, una mezcla de proteínas o una mezcla de proteínas de célula hospedadora y una proteína diana sobreexpresada.

7. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, incubándose después de la adición de la solución de equilibrado y/o la solución de ensayo y/o la solución de lavado y/o la solución de elución el material de 55 cromatografía con la solución de equilibrado, ensayo, lavado o elución.

8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los eluatos de la o de las etapas de elución y opcionalmente además las soluciones de paso de las etapas de carga y lavado se recogen y se analizan.