Novedosos compuestos inmunoadyuvantes basados en flagelina y uso de los mismos.

Un compuesto inmunoadyuvante que comprende:

a) un péptido del extremo N-terminal que tiene al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos que comienza en el residuo de aminoácido localizado en la posición 1 de SEC ID Nº 1 y que termina en un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en uno cualquiera de los residuos de 5 aminoácidos localizados en las posiciones 99 a 173 de SEC ID Nº 1;

y

b) un péptido del extremo C-terminal que tiene al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos que comienza en un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en uno cualquiera de los residuos de aminoácidos localizados en las posiciones 401 a 406 de SEC ID Nº 1 y que termina en el residuo de aminoácido localizado en la posición 494 de SEC ID Nº 1, en el que:

- dicho péptido del extremo N-terminal está directamente ligado a dicho péptido del extremo C, o

- dicho péptido del extremo N-terminal y dicho péptido del extremo C-terminal están directamente ligados, el uno con el otro, mediante una cadena espaciadora, en el que la cadena espaciadora consiste en 1-20 aminoácidos ligados por enlaces peptídicos, en el que los aminoácidos están seleccionados de los aminoácidos naturales y en el que el compuesto no es SEC ID Nº: 15, 628, 630, 632, 634, 713, 715, 717, 15 719 ó 721 del documento WO 2009/128950.

Novedosos compuestos inmunoadyuvantes basados en flagelina y uso de los mismos Campo de la invención La presente invención se refiere a la inducción y/o estimulación de la respuesta inmunitaria en un individuo o un animal.

Se refiere en particular a nuevos compuestos inmunoadyuvantes útiles para composiciones inmunogénicas y de vacuna.

Antecedentes de la invención El desarrollo de vacunas seguras y eficaces sigue siendo un objetivo importante en la salud pública mundial.

En particular, las vacunas llamadas “mucosas” han emergido como una posible y atractiva alternativa a vacunas inyectables.

La administración por la mucosa tiene muchos atributos potencialmente deseables. Quizás el motivo más persuasivo para desarrollar técnicas de administración de vacunas por la mucosa sea el desarrollo de una defensa de inmunidad de primera línea, generando inmunidad local en el sitio mucoso de entrada para muchos patógenos invasores.

Además, algunos investigadores han informado que existe un sistema inmunitario mucoso común, por lo que la inmunidad mucosa inducida en un sitio puede conducir a inmunidad en un sitio mucoso distal (McGhee, J. R. y col. The mucosal immune system: from fundamental concepts to vaccine development. Vaccine 1992, 10:75-88) .

Además, la administración de un antígeno mediante un sitio mucoso tiene la posibilidad de generar también una respuesta inmunitaria sistémica.

Esto sugiere que pueden lograrse beneficios significativos por la administración de vacunas de una forma no invasiva, por ejemplo, intranasalmente u otra vía mucosa, para provocar inmunidad a una amplia gama de patógenos que pueden entrar en diferentes sitios mucosos.

La mayoría de las vacunas de nuestros días (vacunas mucosas u otras) están compuestas de dos componentes principales: (i) el antígeno diana de interés terapéutico y (ii) compuesto (s) inmunoadyuvante (s) que estimulan y/o inducen inmunogenicidad contra dicho antígeno.

La naturaleza de los inmunoadyuvantes conocidos varía enormemente, pero incluye en particular aceites minerales, extractos bacterianos, organismos vivos y atenuados, y suspensiones de metales de hidróxido de aluminio.

Aunque los adyuvantes proporcionan respuestas inmunitarias potenciadas, su uso también puede provocar efectos secundarios adversos, en función en particular de su vía administrada. Por tanto, los números de adyuvantes que están aprobados y son eficaces en seres humanos siguen siendo relativamente limitados.

Los avances en el campo de la inmunidad innata han proporcionado un mejor entendimiento de tanto los mecanismos celulares como moleculares que gobiernan la regulación de la respuesta inmunitaria del huésped.

Este mejor conocimiento del sistema inmunitario ha permitido la investigación y desarrollo de nuevos posibles inmunoadyuvantes útiles.

En particular, los receptores similares a toll (TLR) son fundamentales en la inducción coordinada de inmunidad innata y adaptativa en mamíferos. Como los TLR son expresados por una amplia variedad de tipos de células, pueden estimular la inmunidad por todo el organismo.

Tras la infección por microorganismos patógenos, los TLR reconocen motivos conservados denominados patrones moleculares asociados a microbios (MAMP) . La interacción de TLR induce un programa de expresión génica dedicado a tanto la eliminación innata de como la inmunidad adquirida a microorganismos patógenos. Por ejemplo, los TLR inducen la producción de quimiocinas que, a su vez, atraen específicamente los neutrófilos polimorfonucleares (PMN) directamente implicados en la eliminación microbiana innata. Además, los TLR promueven la secreción de mediadores inmunes pleiotrópicos (tales como TNFa) y la maduración funcional de células dendríticas (CD) que se especializan en presentación de antígeno a linfocitos.

Por consiguiente, los agonistas de TLR no solo estimulan respuestas inmunitarias pro-inflamatorias “ampliamente específicas”, sino que también potencian la respuesta inmunitaria adaptativa a antígenos, y así se considera que son inmunoadyuvantes.

A pesar de estos efectos posiblemente beneficiosos, la toxicidad sistémica de MAMP ha dado lugar a esfuerzos para desarrollar derivados que inclinen la actividad de MAMP hacia la adyuvancia. De hecho, moléculas manipuladas con propiedades únicas es un reto importante en la manipulación de respuestas inmunitarias.

Las flagelinas bacterianas (los principales componentes del flagelo en muchos patógenos bacterianos) son agonistas únicos específicos para la activación de TLR5.

La flagelina FliC de Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) es el paradigma de estudios sobre la estructura-función de flagelo, inmunidad y señalización de TLR5.

Es una proteína de 494 aminoácidos con dos dominios distintos. Las regiones “conservadas” en el extremo amino y carboxi forman un dominio que es esencial para la activación de TLR5.

El dominio central de la flagelina FliC comprende aminoácidos no obligatorios para la señalización de TLR5. Se designa una región “hipervariable”, ya que las secuencias primarias varían enormemente en composición y tamaño de una especie bacteriana a otra. A diferencia, se sabe que la región hipervariable es esencial para la antigenicidad de la flagelina.

Se ha mostrado que la inyección intravenosa (i.v.) de flagelinas promueve una respuesta sistémica, caracterizada por la producción de mediadores pro-inflamatorios (tales como TNFa o IL-6) y activación de CD.

Además, las flagelinas desencadenan mecanismos de defensa innatos y adaptativos específicos de mucosa. Por ejemplo, líneas celulares epiteliales y mucosa de pulmón regulan por incremento la producción de quimiocinas como CXCL8 (IL-8) y CCL20 que, a su vez, reclutan PMN y CD mucosos, respectivamente.

Diversos autores también han informado de que las flagelinas son potentes inmunoadyuvantes sistémicos y mucosos que provocan (i) respuestas de anticuerpos en suero y/o secretoras y (ii) respuestas de células Th1 y Th2 a tanto las propias flagelinas como a antígenos co-administrados.

Debido a sus potentes actividades de inmunoadyuvante sistémico y mucoso, las flagelinas pueden ser particularmente interesantes para el desarrollo de vacuna, y en particular de tipo de vacuna mucosa. Tal uso se ha propuesto en el documento WO-A-2004 022092.

Sin embargo, la mayoría de dichos adyuvantes tipo flagelina no son completamente adecuados para tal aplicación de vacuna, y en particular para dicha estrategia de vacuna mucosa.

De hecho, los adyuvantes de flagelina conocidos muestran efectos secundarios importantes, y en particular actividad antigénica intrínseca y propiedades pro-inflamatorias sistémicas cuando se administran in vivo.

Además, la mayoría de los inmunoadyuvantes tipo flagelina conocidos necesitan estar físicamente ligados al antígeno diana, con el fin de provocar una potente respuesta inmunitaria cuando se administran in vivo. Este requisito obliga a complejas manipulaciones adicionales para obtener un enlace flagelina-antígeno adecuado, y la sustancia inmunogénica útil final.

Por tanto, existe la necesidad de nuevos compuestos que puedan usarse como adyuvantes inmunológicos, en particular para inducir y/o para potenciar la respuesta inmunitaria mucosa contra un antígeno, en particular sin desencadenar ningún efecto secundario de inflamación sistémica significativo.

Estos nuevos compuestos deben también ser capaces de desencadenar ventajosamente una respuesta inmunitaria por una simple mezcla con el antígeno diana.

La presente invención propone entonces nuevos compuestos inmunoadyuvantes que satisfacen esta necesidad, y que pueden ser particularmente útiles para la producción de composiciones inmunogénicas y de vacuna (en particular de tipo mucoso) .

Sumario de la invención Se ha encontrado, según la invención, novedosos compuestos de péptido derivados de flagelina que se originan a partir de Salmonella enterica serovar Typhimurium de tipo SEC ID Nº 1, que presentan una actividad adyuvante in vivo como se ilustra en los ejemplos en la presente memoria.

También se ha mostrado según la presente invención que estos novedosos compuestos adyuvantes presentan en particular propiedades de adyuvante mucoso, sin ejercer efectos pro-inflamatorios sistémicos significativos.

Dichos nuevos compuestos derivados de flagelina de la invención son así particularmente útiles como sustancias inmunoadyuvantes, ventajosamente para inducir y/o para potenciar una respuesta inmunitaria mucosa.

Así, la presente invención se refiere... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto inmunoadyuvante que comprende:

a) un péptido del extremo N-terminal que tiene al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos que comienza en el residuo de aminoácido localizado en la posición 1 de SEC ID Nº 1 y que termina en un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en uno cualquiera de los residuos de aminoácidos localizados en las posiciones 99 a 173 de SEC ID Nº 1; y

b) un péptido del extremo C-terminal que tiene al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos que comienza en un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en uno cualquiera de los residuos de aminoácidos localizados en las posiciones 401 a 406 de SEC ID Nº 1 y que termina en el residuo de aminoácido localizado en la posición 494 de SEC ID Nº 1, en el que:

- dicho péptido del extremo N-terminal está directamente ligado a dicho péptido del extremo C, o

- dicho péptido del extremo N-terminal y dicho péptido del extremo C-terminal están directamente ligados, el uno con el otro, mediante una cadena espaciadora, en el que la cadena espaciadora consiste en 1-20 aminoácidos ligados por enlaces peptídicos, en el que los aminoácidos están seleccionados de los 20 aminoácidos naturales y en el que el compuesto no es SEC ID Nº: 15, 628, 630, 632, 634, 713, 715, 717, 719 ó 721 del documento WO 2009/128950.

2. Un compuesto inmunoadyuvante que comprende:

a) un péptido del extremo N-terminal que tiene al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos que comienza en el residuo de aminoácido localizado en la posición 1 de SEC ID Nº 1 y que termina en un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en uno cualquiera de los residuos de aminoácidos localizados en las posiciones 99 a 173 de SEC ID Nº 1; y

b) un péptido del extremo C-terminal que tiene al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos que comienza en un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en uno cualquiera de los residuos de aminoácidos localizados en las posiciones 401 a 406 de SEC ID Nº 1 y que termina en el residuo de aminoácido localizado en la posición 494 de SEC ID Nº 1, en el que:

- dicho péptido del extremo N-terminal está directamente ligado a dicho péptido del extremo C, o

- dicho péptido del extremo N-terminal y dicho péptido del extremo C-terminal están directamente ligados, el uno con el otro, mediante una cadena espaciadora, en el que la cadena espaciadora consiste en 1-20 aminoácidos ligados por enlaces peptídicos, en el que los aminoácidos están seleccionados de los 20 aminoácidos naturales

en el que dicho péptido del extremo N-terminal está seleccionado del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos 1-99, 1-137, 1-160 y 1-173 de SEC ID Nº 1.

3. Un compuesto inmunoadyuvante que comprende:

a) un péptido del extremo N-terminal que tiene al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos que comienza en el residuo de aminoácido localizado en la posición 1 de SEC ID Nº 1 y que termina en un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en uno cualquiera de los residuos de aminoácidos localizados en las posiciones 99 a 173 de SEC ID Nº 1; y

b) un péptido del extremo C-terminal que tiene al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos que comienza en un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en uno cualquiera de los residuos de aminoácidos localizados en las posiciones 401 a 406 de SEC ID Nº 1 y que termina en el residuo de aminoácido localizado en la posición 494 de SEC ID Nº 1, en el que:

- dicho péptido del extremo N-terminal está directamente ligado a dicho péptido del extremo C, o

- dicho péptido del extremo N-terminal y dicho péptido del extremo C-terminal están directamente ligados, el uno con el otro, mediante una cadena espaciadora, en el que la cadena espaciadora consiste en 1-20 aminoácidos ligados por enlaces peptídicos, en el que los aminoácidos están seleccionados de los 20 aminoácidos naturales

en el que dicho péptido del extremo C-terminal está seleccionado del grupo que consiste en las secuencias de aminoácido.

40. 494 .

40. 494 de SEC ID Nº 1.

4. El compuesto inmunoadyuvante según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, en el que dichos péptidos del extremo N-terminal y del extremo C-terminal consisten en las secuencias de aminoácidos 1-173 .

40. 494 de SEC ID Nº 1, respectivamente.

5. El compuesto inmunoadyuvante según cualquiera de las reivindicaciones 2-3, en el que dichos péptidos del extremo N-terminal y del extremo C-terminal consisten en las secuencias de aminoácidos 1-160 .

40. 494 de SEC ID Nº 1, respectivamente.

6. El compuesto inmunoadyuvante según cualquiera de las reivindicaciones 2-3, en el que dichos péptidos del extremo N-terminal y del extremo C-terminal consisten en las secuencias de aminoácidos 1-137 .

40. 494 de SEC ID Nº 1, respectivamente.

7. El compuesto inmunoadyuvante según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que dicho péptido del extremo N-terminal y dicho péptido del extremo C-terminal están directamente ligados, el uno con el otro, mediante una cadena espaciadora intermedia que consiste en una secuencia de péptidos NH2-Gly-Ala-Ala-Gly-COOH.

8. Un compuesto inmunoadyuvante que comprende:

a) un péptido del extremo N-terminal que tiene al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos que comienza en el residuo de aminoácido localizado en la posición 1 de SEC ID Nº 1 y que termina en un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en uno cualquiera de los residuos de aminoácidos localizados en las posiciones 99 a 173 de SEC ID Nº 1; y

b) un péptido del extremo C-terminal que tiene al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos que comienza en un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en uno cualquiera de los residuos de aminoácidos localizados en las posiciones 401 a 406 de SEC ID Nº 1 y que termina en el residuo de aminoácido localizado en la posición 494 de SEC ID Nº 1, en el que:

- dicho péptido del extremo N-terminal está directamente ligado a dicho péptido del extremo C, o

- dicho péptido del extremo N-terminal y dicho péptido del extremo C-terminal están directamente ligados, el uno con el otro, mediante una cadena espaciadora, en el que la cadena espaciadora consiste en 1-20 aminoácidos ligados por enlaces peptídicos, en el que los aminoácidos están seleccionados de los 20 aminoácidos naturales

en el que el residuo de aminoácido asparagina localizado en la posición 488 de SEC ID Nº 1 está sustituido con una serina.

9. Un compuesto inmunoadyuvante según cualquier reivindicación precedente en el que dicho compuesto comprende un residuo de metionina adicional en el extremo N-terminal.

10. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto inmunoadyuvante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

11. Una composición inmunogénica que comprende un compuesto inmunoadyuvante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, junto con uno o más antígenos.

12. Una composición de vacuna que comprende un compuesto inmunoadyuvante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, junto con uno o más antígenos.

13. La composición inmunogénica según la reivindicación 11 o la composición de vacuna según la reivindicación 12, en la que dicho compuesto inmunoadyuvante no está ligado covalentemente a dichos uno o más antígenos.

14. El compuesto inmunoadyuvante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para su uso como un medicamento.

15. El uso de un compuesto inmunoadyuvante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para fabricar una composición farmacéutica.

16. Un ácido nucleico que codifica el compuesto inmunoadyuvante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

17. Un vector recombinante que comprende, insertado en el mismo, el ácido nucleico de la reivindicación 16, el ácido nucleico codificando un compuesto inmunoadyuvante que comprende:

a) un péptido del extremo N-terminal que tiene al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos que comienza en el residuo de aminoácido localizado en la posición 1 de SEC ID Nº 1 y que termina en un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en uno cualquiera de los residuos de aminoácidos localizados en las posiciones 99 a 173 de SEC ID Nº 1; y

b) un péptido del extremo C-terminal que tiene al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos que comienza en un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en uno cualquiera de los residuos de aminoácidos localizados en las posiciones 401 a 406 de SEC ID Nº 1 y que termina en el residuo de aminoácido localizado en la posición 494 de SEC ID Nº 1, en el que:

- dicho péptido del extremo N-terminal está directamente ligado a dicho péptido del extremo C, o

- dicho péptido del extremo N-terminal y dicho péptido del extremo C-terminal están directamente ligados, el uno con el otro, mediante una cadena espaciadora, en el que la cadena espaciadora consiste en 1-20 aminoácidos ligados por enlaces peptídicos, en el que los aminoácidos están seleccionados de los 20 aminoácidos naturales.

18. Una célula huésped transfectada o transformada con el vector recombinante de la reivindicación 17 o con un ácido nucleico que codifica un compuesto inmunoadyuvante que comprende:

a) un péptido del extremo N-terminal que tiene al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos que comienza en el residuo de aminoácido localizado en la posición 1 de SEC ID Nº 1 y que termina en un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en uno cualquiera de los residuos de aminoácidos localizados en las posiciones 99 a 173 de SEC ID Nº 1; y

b) un péptido del extremo C-terminal que tiene al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos que comienza en un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en uno cualquiera de los residuos de aminoácidos localizados en las posiciones 401 a 406 de SEC ID Nº 1 y que termina en el residuo de aminoácido localizado en la posición 494 de SEC ID Nº 1, en el que:

- dicho péptido del extremo N-terminal está directamente ligado a dicho péptido del extremo C, o

- dicho péptido del extremo N-terminal y dicho péptido del extremo C-terminal están directamente ligados, el uno con el otro, mediante una cadena espaciadora, en el que la cadena espaciadora consiste en 1-20 aminoácidos ligados por enlaces peptídicos, en el que los aminoácidos están seleccionados de los 20 aminoácidos naturales.