Célula de Salmonella atenuada que comprende el locus génico SPI2,

en la que por lo menos un gen del locus SPI2 está inactivado, en la que dicha inactivación produce una atenuación/reducción de la virulencia en comparación con el tipo natural de dicha célula y en la que por lo menos un gen adicional dispuesto fuera del locus SPI2 está inactivado, en la que la inactivación produce una atenuación/reducción adicional de la virulencia en comparación con el tipo natural

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En 1996, más de 17 millones de personas en todo el mundo, principalmente en países en desarrollo, murieron por diversas infecciones. La aparición y la propagación de resistencias a antibióticos unido al aumento en los viajes por todo el mundo ha conducido a un riesgo creciente del brote de infecciones pandémicas. Esta posibilidad debe 5 considerarse seriamente puesto que, para algunas bacterias patógenas, las alternativas terapéuticas disponibles se han reducido a una única opción. De manera desconcertante, también se ha descubierto que las bacterias patógenas son un factor relevante en muchas enfermedades crónicas. El cáncer de estómago, por ejemplo, es el segundo cáncer más común en todo el mundo y está directamente vinculado con infecciones crónicas por Helicobacter pylori. Se ha detectado Chlamydia pneumoniae en placas arterioscleróticas y recientemente se ha encontrado esta bacteria en las 10 regiones con enfermedad del cerebro de personas que padecen enfermedad de Alzheimer. Muchas enfermedades autoinmunitarias, tales como artritis reumatoide, parecen tener un origen bacteriano. Borrelia burgdorferi es, además de muchas otras bacterias, un ejemplo prominente de un organismo que provoca una enfermedad que afecta a números crecientes de personas. Finalmente, se han identificado Nanobacteria en los riñones con enfermedad crónica de pacientes con depósitos cristalinos. Otras enfermedades crónicas graves están provocadas por patógenos virales, los 15 más clínicamente relevantes son los virus de la hepatitis B y C (cáncer de hígado) y el virus del papiloma humano (cáncer de cuello uterino).

La importancia clínica creciente de los patógenos bacterianos ha provocado un aumento del debate referente al paradigma de la prevención o el tratamiento médico como medio para tratar enfermedades crónicas. Consecuentemente, algunas enfermedades crónicas se han curado satisfactoriamente mediante tratamiento con 20 antibióticos. Sin embargo, tal como se indicó anteriormente, todos los microorganismos son genéticamente capaces de generar rápidamente progenies con resistencias a antibióticos adecuadas, impidiendo así el tratamiento de rutina eficaz. De manera concluyente, las vacunas representan una alternativa excelente a los fármacos farmacológicos y, considerando el aspecto económico de que la prevención de la enfermedad presenta costes menos elevados que la terapia, la opción de vacunación es incluso más atractiva. Por tanto, el enfoque de vacunación terapéutica ha adquirido 25 particular relevancia, especialmente con respecto al tratamiento de cáncer y enfermedades bacterianas o virales crónicas.

El enfoque más frecuentemente puesto en práctica utiliza la administración oral de o bien patógenos inactivados (vacuna muerta) o bien inyecciones parenterales de una mezcla definida de componentes purificados (vacunas de subunidades). La mayoría de las vacunas muertas son eficaces, sin embargo, el riesgo de que el 30 procedimiento de inactivación esté inacabado y que el vacunado se infecte sigue siendo un problema. Además, las vacunas muertas muy a menudo no cubren todas las variantes genéticas que aparecen en la naturaleza. Las vacunas de subunidades suprimen la mayoría de las desventajas de las vacunas muertas tradicionales. Sin embargo, requieren preparaciones de antígeno y adyuvantes tecnológicamente avanzadas, lo que hace que tales vacunas sean relativamente caras. Además, las vacunas de subunidades se inoculan preferentemente por vía parenteral, que no es la 35 ruta óptima para provocar una respuesta inmunitaria amplia. En particular, la rama de la mucosa del sistema inmunitario, que es la línea primaria de protección contra muchos patógenos, está fuertemente desaprovechada por las inmunizaciones parenterales.

Otra generación de vacunas está representada por vacunas atenuadas vivas, que se basan en virus o bacterias patógenas que se han mutado para proporcionar variantes no patógenas. Estas variantes se multiplican in vivo durante 40 un periodo de tiempo limitado antes de que el huésped las elimine completamente. Su prevalencia limitada en el tejido del huésped es suficiente para estimular adecuadamente el sistema inmunitario del huésped, que entonces puede establecer una respuesta inmunitaria protectora. Con respecto al aspecto de seguridad, las vacunas bacterianas atenuadas vivas están más favorecidas que las vacunas virales atenuadas vivas. Si una vacuna bacteriana viva se convierte en una amenaza para un vacunado, las bacterias atenuadas pueden controlarse generalmente mediante 45 tratamiento con antibióticos. En cambio, las vacunas virales vivas, que utilizan el aparato de replicación de la célula huésped, son casi imposibles de controlar. Las vacunas bacterianas vivas se administran normalmente por vía oral y sirven como estimuladores excelentes del sistema inmunitario de la mucosa. Además, las vacunas bacterianas vivas son también buenos estimuladores del sistema inmunitario sistémicamente activo, concretamente las ramas humoral y celular. Debido a estas excelentes características inmunoestimuladoras, las cepas de vacunas bacterianas vivas, tales 50 como Salmonella, son portadores ideales para expresar antígeno de un patógeno heterólogo. Tales vacunas bivalentes (o multivalentes) median la protección frente a dos patógenos: el patógeno homólogo al portador así como el patógeno cuyo(s) antígeno(s) protector(es) se expresa(n) mediante el portador. Aunque no está actualmente en utilización ninguna vacuna bacteriana bivalente que exprese antígenos heterólogos, los posibles portadores actualmente en investigación incluyen Bacille Calmette-Guerin (BCG), especies de Salmonella, Vibrio cholerae y Escherichia coli. 55

En el proceso de atenuación, se dirigen preferentemente mutaciones a genes que soportan la supervivencia del patógeno en el huésped. Inicialmente, se aplicaron regímenes de mutación química a la cepa Ty2 de Salmonella typhi, dando como resultado lo que se pensó que eran patógenos perfectamente atenuados que podían mediar la inmunidad protectora, en contraposición al homólogo muerto. Sin embargo, ensayos clínicos a gran escala posteriores revelados que tales cepas no eran todavía suficientemente eficaces en la prevención de la fiebre tifoidea. Parece que tales cepas 60 estaban mutadas en varios genes, dando como resultado una sobreatenuación, que afecta de manera adversa al

potencial inmunogénico de la cepa. Se han desarrollado cepas de vacuna tifoidea novedosas mediante la introducción de mutaciones genéticamente definidas. La mayoría de estas mutaciones se han establecido en S. typhimurium. La infección con S. typhimurium provoca síntomas similares a la fiebre tifoidea en ratones y la salmonelosis murina es un modelo bien aceptado para la fiebre tifoidea humana. Tales cepas de vacuna contienen mutaciones en proteínas que provocan deficiencias en la biosíntesis de aminoácidos aromáticos (por ejemplo aroA, aroC y aroD) o purinas (por 5 ejemplo purA y purE), en el gen de la adenilato ciclasa (cya) o la proteína receptora de AMPc (crp), o poseen mutaciones que afectan a la regulación de varios factores de virulencia (phoP y phoQ). Sin embargo, aunque varios mutantes atenuados se han generado y caracterizado en el modelo de ratón con respecto a su papel en la virulencia, relativamente pocos de ellos se han evaluado como portadores de vacuna en seres humanos. El motivo de esto es que los mutantes utilizados son o bien todavía demasiado virulentos, provocando efectos secundarios graves en el huésped, 10 o bien no son suficientemente inmunogénicos, debido a una presentación inadecuada al sistema inmunitario, que requiere un nivel crítico de persistencia de la cepa de vacuna en el huésped para la activación.

Un reciente estudio reveló que la inactivación de genes de Salmonella individuales provocando la atenuación de la virulencia influye directamente en la calidad de una respuesta inmunitaria contra la cepa portadora de vacuna. Partiendo de este hallazgo, puede concluirse que podría ser posible generar una variedad de cepas de vacuna de 15 Salmonella atenuadas de manera diferente, cada una con un perfil único y capacidades individuales para provocar una respuesta inmunitaria. Con este repertorio, podría ser posible confeccionar una cepa de vacuna según exigencias inmunológicas específicas. Como consecuencia lógica, también deben poderse desarrollar cepas de vacuna de Salmonella atenuadas para fines o bien profilácticos o bien terapéuticos. Sin embargo, deben determinarse los medios mediante los cuales se obtiene y se desarrolla adicionalmente un repertorio representativo de este tipo de cepas... [Seguir leyendo]

1. Célula de Salmonella atenuada que comprende el locus génico SPI2, en la que por lo menos un gen del locus SPI2 está inactivado, en la que dicha inactivación produce una atenuación/reducción de la virulencia en comparación con el tipo natural de dicha célula y en la que por lo menos un gen adicional dispuesto fuera del locus SPI2 está inactivado, en la que la inactivación produce una atenuación/reducción adicional de la virulencia en comparación 5 con el tipo natural.

2. Célula de Salmonella atenuada según la reivindicación 1, en la que dicho gen adicional es un gen aro.

3. Célula de Salmonella atenuada según la reivindicación 2, en la que el gen aro es aroA.

4. Célula de Salmonella atenuada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho por lo menos un gen en el locus SPI2 se selecciona de entre genes efectores (sse), genes del aparato de secreción (ssa), 10 genes de chaperonas (ssc) y genes reguladores (ssr).

5. Célula de Salmonella atenuada según la reivindicación 1, en la que la inactivación de dicho gen se efectúa mediante una deleción, o una inserción o una combinación de deleción e inserción.

6. Célula de Salmonella atenuada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la Salmonella es S. typhimurium o S. typhi. 15

7. Célula de Salmonella atenuada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para la presentación de un antígeno a un huésped, en la que dicha célula comprende por lo menos una molécula de ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica dicho antígeno, pudiendo dicha célula expresar dicha molécula de ácido nucleico.

8. Célula de Salmonella atenuada según la reivindicación 7, en la que la secuencia de ácido nucleico que 20 codifica dicho antígeno está en un casete de expresión génica.

9. Célula de Salmonella atenuada según la reivindicación 8, en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica dicho antígeno está bajo el control de un promotor de Salmonella.

10. Célula de Salmonella atenuada según las reivindicaciones 8 a 9, en la que dicho casete de expresión génica comprende además una secuencia auxiliar para la secreción del antígeno. 25

11. Célula de Salmonella atenuada según la reivindicación 7, en la que el antígeno es un antígeno bacteriano o viral o tumoral.

12. Célula de Salmonella atenuada según la reivindicación 11, en la que el antígeno es un antígeno del virus de la hepatitis (tal como hepatitis B o C), virus del papiloma humano, herpesvirus, Helicobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Borrelia burgdorferi o Nanobacteria. 30

13. Célula de Salmonella atenuada según la reivindicación 7, en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno está fusionada a una secuencia de ácido nucleico que codifica una parte de proteína inmunológicamente reactiva.

14. Célula de Salmonella atenuada según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, en la que la molécula de ácido nucleico heterólogo está insertada en el locus SPI2. 35

15. Célula de Salmonella atenuada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su utilización en medicina.

16. Composición farmacéutica que comprende una célula de Salmonella atenuada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y un diluyente, portador y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

17. Célula de Salmonella atenuada según la reivindicación 1, para su utilización en el tratamiento preventivo o 40 terapéutico de una enfermedad provocada por Salmonella.

18. Célula de Salmonella atenuada según la reivindicación 11 y 13, en la que el antígeno es un antígeno tumoral, para su utilización en el tratamiento preventivo o terapéutico de un tumor.

19. Célula de Salmonella atenuada según la reivindicación 11, en la que el antígeno es un antígeno viral, para su utilización en el tratamiento preventivo o terapéutico de una enfermedad provocada por dicho virus. 45

20. Célula de Salmonella atenuada según la reivindicación 11, en la que el antígeno es un antígeno bacteriano, para su utilización en el tratamiento preventivo o terapéutico de una enfermedad provocada por dicha bacteria.

21. Célula de Salmonella atenuada según la reivindicación 7, para su utilización en la presentación del antígeno a un huésped. 50