Nueva cepa de Salmonella enterica s. Typhimurium, su uso y un procedimiento para obtener un vector de vacuna terapéutico.

Una cepa de Samonella enterica serovariedad Typhimurium VNP/sipB depositada en la Polish Collection of Microorganisms con el n.º de referencia B/00024.

Nueva cepa de Salmonella enterica s. Typhimurium, su uso y un procedimiento para obtener un vector de vacuna terapéutico La presente invención se refiere al campo de farmacia, en particular la preparación de vacunas, en especial de vacunas terapéuticas bacterianas antineoplásicas.

Las bacterias que pertenecen al género Salmonella son bacterias Gram-negativas de la familia Enterobacteriasceae que provocan enfermedades en seres humanos y animales, y representan un problema médico y veterinario serio.

La vacunación con cepas atenuadas, vivas, de Salmonella es una forma eficaz para evitar la infección. Se obtuvieron cepas atenuadas de Salmonella introduciendo mutaciones irreversibles específicas en determinados genes en el cromosoma de Salmonella, tales como: aroA (1) , aroC (2) , surA (3) , htrA (4) , rpoS (5) , y galE (6) .

Los procedimientos actuales de atenuación de Salmonella que se usan para obtener material de vacuna se basan en la introducción de deleciones genéticamente estables que reducen o eliminan la virulencia de las bacterias, aunque no cambian ni intensifican su inmunogenicidad.

Por medio de la atenuación de la cepa natural Salmonella typhi, se creó una nueva Ty21a y se usó para la vacunación contra la fiebre tifoidea. La atenuación de esta cepa se ha logrado por medio de varias mutaciones inducidas por mutágenos químicos. Esto ha dado como resultado una cepa que es sensible a la galactosa (una mutación en el gen galE) , auxotrófica para isoleucina y valina (mutaciones en genes UvD) , tiene una resistencia al estrés reducida (una mutación en rpoS) , y además no puede producir el polisacárico Vi. La pluralidad de las mutaciones hace que la cepa sea genéticamente estable y segura. No se observaron mutaciones revertidas dentro de los genes con virulencia ni in vitro ni in vivo (7, 8) .

La cepa CVD908 tiene mutaciones claramente definidas en los genes aroC y aroD, pero provoca fiebre y otras reacciones adversas en voluntarios vacunados con dosis altas. Una atenuación adicional de esta cepa por la deleción del gen htrA, que codifica una serina proteasa esencial para la supervivencia bacteriana en macrófagos, condujo a la cepa CVD908-htrA, que es bien tolerada incluso a dosis altas y muestra una alta inmunogenicidad (9) .

Los mutantes de Salmonella enterica serovariedad Typhimurium, que carecen del regulador de la transcripción RfaH evitan eficazmente la salmonelosis cuando se usan para vacunar ratones. La carencia de RfaH afecta a la expresión de genes implicados en la síntesis del núcleo de lipopolisacárido y O-antígeno. Dichos mutantes no difieren en su capacidad de proliferar, pero muestran un incremento en la susceptibilidad a péptidos antibacterianos (10) .

Debido a la especificidad de las vacunas preventivas, destinadas a provocar una memoria inmunitaria después de la administración, se actividad se puede basar en la capacidad de las bacterias atenuadas para estimular una respuesta inmunitaria humoral (producción de anticuerpos neutralizantes) . La generación de una respuesta humoral eficaz no requiere la capacidad para invadir células huésped por las vacunas de Salmonella sp. Esto significa que incluso las deleciones relativamente grandes en el cromosoma de Salmonella sp. se pueden tolerar en el material de vacunación preparado para su uso como vacuna preventiva. Sin embargo, la relativa facilidad de atenuación no siempre coincide con la retención de la inmunogenicidad original (eficaz) .

Un vector de vacuna terapéutico debe estar altamente atenuado y ser posiblemente poco inmunogénico para proporcionar eficacia de administración repetida en un paciente. En el caso de antígenos (epítopos) heterogéneos (alio- o xenogénicos) conjugados, el vector debe demostrar propiedades adyuvantes (mientras mantiene su baja inmunogenicidad) . Un vector terapéutico debe ser capaz de estimular un tipo específico de respuesta inmunitaria, esto es de inducir una respuesta humoral (Th2) o celular (Th1) según sea necesario.

La cepa VNP20009 se desarrolló como un vector de vacuna cuyo cometido era el de enviar precursores de fármaco citostático no tóxicos (profármacos) al tejido tumoral (9, 10) . Las deleciones dentro de los genes purl y msbB dan como resultado un auxotrofismo de la cepa con una capacidad reducida para estimular TNF en el organismo infectado. Estudios preliminares han mostrado la capacidad de acumulación preferente de VNP20009 sin tumores en ratones (11) . También se descubrió que VNP20009 tiene un efecto inhibidor sobre el desarrollo tumoral. Estudios clínicos en fase I no han confirmado los efectos en mamíferos pequeños. Hasta el momento, no existen estudios sobre la inmunogenicidad de VNP20009 en ratones ni en seres humanos (12) .

La expresión en superficie del fragmento variable de un anticuerpo específico de CEA (T84, 66) mejoró la capacidad de acumulación selectiva de las bacterias en tumores malignos (13) . Sin embargo, la tensión provocada por la sobreexpresión de la proteína de fusión OmpA-scFv (específica de CEA) redujo sustancialmente (100 veces) la invasividad de VNP20009 transformado (designado VNP/scFv) . A pesar de la reducción en la invasividad, se observó un incremento en los efectos terapéuticos para VNP/scFv frente a VNP20009 en modelos murinos de tumores trasplantables transfectados de forma estable con el gen CEA humano (adenocarcinomas MC38CEA y CT26CEA) . Otro motivo para la reducción en la eficacia de VNP/scFv probablemente es la inestabilidad genética de la cepa lo que implica la pérdida del plásmido (y por tanto la pérdida de capacidad para expresar OmpA-scFv) en ausencia de presión de selección de antibiótico. La reversión a VNP20009 natural en el paciente no promovería la dirección de las bacterias hacia sitios ricos en CEA (tejido tumoral) .

En el caso de un vector de Salmonella sp., es importante retener las características invasoras de las bacterias, lo que está relacionado con la calidad de los mecanismos inmunitarios estimulados por esas bacterias.

Aun existe una gran necesidad de desarrollar los conocimientos en el campo de las vacunas terapéuticas. Una cuestión particularmente importante es el impacto de los efectos relacionados con la atenuación sobre la resistencia y el tipo de respuesta inmunitaria dependiente del tipo de microorganismo.

El propósito de la presente invención es el de proporcionar un vector de vacuna eficaz, en particular eficaz para el tratamiento de cáncer.

Por lo tanto, el objetivo de la presente invención es el de obtener la cepa apropiada de Salmonella sp., de conformidad con la demanda en el campo de las vacunas terapéuticas como un vector para la administración de material terapéutico de células objetivo, en particular células cancerosas, células infectadas con un virus, etc., con inmunogenicidad que resulta de la localización intracelular fisiológica de las bacterias. El objetivo de la presente invención es una cepa de Salmonella enterica serovariedad Typhimurium VNP20009 depositada en la Polish Collection of Microorganisms con el n.º de referencia B/00024. Otro objetivo de la presente invención es el uso de la cepa de Salmonella enterica serovariedad Typhimurium VNP20009 depositada en el Polish Collection of Microorganisms con el n.º de referencia B/00024 para producir una vacuna, en especial una vacuna antineoplásica.

Otro objetivo de la presente invención es un procedimiento de obtención de un vector de vacuna terapéutica, caracterizado porque se introduce una modificación genética en la cepa de vector Salmonella enterica serovariedad Typhimurium VNP20009 específica para células cancerosas, lo que da como resultado una sobreexpresión retardada de un gen que codifica una proteína responsable de las características invasivas de esta cepa, en el que se obtiene un casete de expresión, que contiene el gen sipB bajo el control del promotor PsifB que controla su sobreexpresión retardada, y después se integra el casete dentro del cromosoma bacteriano.

Preferentemente, se integra el casete de expresión dentro de un cromosoma bacteriano es el casete PsifB-sipB de acuerdo con SEQ ID 1 o el casete ushA-5'-PsifB-sipB-ushA-3' de acuerdo con SEQ ID 2.

En una realización preferente de la presente invención, el procedimiento incluye una etapa final adicional de retirada de un gen para determinar la resistencia antibiótica del genoma bacteriano.

El objetivo de la presente invención en un modo de realización se deja claro en las figuras, en las que:

La figura 1A muestra la separación electroforética de un producto de PCR en gel de agarosa al 1 % en presencia de bromuro de etidio para la secuencia del gen sipB (1782 pb) obtenida a partir del ADN genómico de una cepa de referencia,... [Seguir leyendo]

1. Una cepa de Samonella enterica serovariedad Typhimurium VNP/sipB depositada en la Polish Collection of Microorganisms con el n.º de referencia B/00024.

2. Aplicación de la cepa Samonella enterica serovariedad Typhimurium VNP/sipB depositada en la Polish Collection

of Microorganisms con el n.º de referencia B/00024 para obtener una vacuna, en especial una vacuna antineoplásica.

3. Procedimiento de obtención de un vector de vacuna terapéutica, caracterizado porque se introduce una modificación genética en la cepa de vector de Salmonella enterica serovariedad Typhimurium VNP20009 específica para células cancerosas, lo que da como resultado la sobreexpresión retardada de un gen que codifica una proteína responsable de la capacidad invasiva de esta cepa, en el que se obtiene un casete de expresión, que contiene el sipB bajo el control del promotor PsifB que controla su sobreexpresión retardada, y después se integra el casete dentro del cromosoma bacteriano.

4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque el casete de expresión integrado en el

cromosoma bacteriano es el casete PsifB-sipB de acuerdo con SEQ ID 1 o el casete ushA-5'-PsifB-sipB-ushA-3’ 15 de acuerdo con SEQ ID 2.

5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque el procedimiento incluye una etapa final adicional de retirada de un gen para determinar la resistencia antibiótica del genoma bacteriano.