Moléculas de unión a nogo-a mejoradas y uso farmacéutico de las mismas.

Una molécula aislada que comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno que se une específicamente al polipéptido NogoA humano (SEQ ID NO:

2) o NiG humano (SEQ ID NO: 3), dicho sitio de unión a antígeno comprende:

• en secuencia las regiones hipervariables CDR-H1- 6A3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2- 6A3 (SEQ ID NO: 9) y CDR-H3- 5 6A3 (SEQ ID NO: 10); y

• en secuencia las regiones hipervariables CDR-L1- 6A3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2- 6A3 (SEQ ID NO: 12) y CDR-L3- 6A3 (SEQ ID NO: 13).

Moléculas de unión a nogo-a mejoradas y uso farmacéutico de las mismas Campo de la invención La invención se relaciona con moléculas de unión a NogoA mejoradas, tal como por ejemplo, anticuerpos monoclonales, derivados o fragmentos Fab de las mismas.

Antecedentes de la invención La regeneración neuronal luego de lesión en el sistema nervioso central de adultos (SNC) se limita debido a la presencia del ambiente inhibidor de mielina que envuelven los axones y la formación de tejido de cicatriz. En años recientes se han adquirido conocimientos importantes en la comprensión molecular del porqué el SNC es incapaz de repararse espontáneamente luego de lesión. Las moléculas inhibidoras en la mielina son el impedimento principal para la regeneración axonal, particularmente inmediatamente después de lesión. Hasta el momento NogoA, Glucoproteína Asociada con Mielina (MAG) y glucoproteína de oligodendrocito-mielina (OMgp) se han caracterizado como inhibidores potentes del crecimiento de neuritas. Adicionalmente, la mielina también contiene otros componentes inhibidores, tal como proteoglicanos de sulfato de condroitina. El Nogo-A es un miembro de la familia de proteína de reticulón y tiene por lo menos dos dominios farmacológicamente distintos y biológicamente activos denominados Amino-Nogo y Nogo-66. Aunque el sitio del receptor para el primero no se conoce hasta ahora, el Nogo-66 inhibe el crecimiento neuronal in vitro e in vivo por medio del receptor neuronal NgR. Además del Nogo-66, el MAG y OMgp también se unen al NgR con alta afinidad e inhiben el crecimiento de neuritas.

Actualmente se siguen nuevos métodos de investigación para la mejora de reparación del nervio que incluyen digestión de tejido de cicatriz utilizando una condroitinasa de enzima ABC, técnicas de puenteado que utilizan células Olfativas envolventes y mastocitos y factores de crecimiento de proteína para estimular el crecimiento neuronal. Se pueden lograr acciones de bloqueo de los inhibidores de crecimiento de neuritas mediante la modulación de mediadores de señalización intracelular tal como Rho, una trifosfatasa de guanosina unida a membrana (GTPasa) , que parece ser un enlace clave en la inhibición del crecimiento axonal. El monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) puede superar la inhibición asociada con mielina in vitro e induce la regeneración in vivo. El inhibidor de péptido del receptor NgR (NEP 1-40) se puede utilizar para inducir el recrecimiento neuronal y la recuperación funcional en ratas luego de lesión espinal.

Además del uso de los métodos descritos anteriormente, también se ha enfocado la atención en el uso de ciertos anticuerpos monoclonales para neutralizar las moléculas inhibidoras de crecimiento de neuritas del sistema nervioso central y periférico, en particular para neutralizar la actividad inhibidora de crecimiento de neuritas de NogoA. Sin embargo se ha mostrado que el anticuerpo monoclonal IN-1 o el fragmento IN-1 Fab del mismo induce el crecimiento de neuritas in vitro y mejora la germinación y la regeneración in vivo (Schwab ME et al. (1996) Physiol. Rev. 76, 319370) . También se han descrito anticuerpos alternativos para IN-1 en los documentos WO2004/052932 (11C7-Ab) y WO2005/028508 (3A6-Ab) . La prueba de diferentes dominios del NogoA para la actividad inhibidora de crecimiento de neuritas ha delineado diversos dominios inhibidores en la molécula (Chen et al. (2000) Nature 403, 434-439; GrandPre et al., (2000) Nature 403, 439-444; Prinjha et al. (2000) Nature 403, 383-384.

Las inmunoglobulinas o anticuerpos naturales comprenden una molécula multimérica generalmente con forma de Y que tiene un sitio de unión a antígeno al final de cada brazo superior. El resto de la estructura, en particular el tallo de Y media las funciones efectoras asociadas con las inmunoglobulinas. Los anticuerpos consisten de 2 cadenas pesadas y 2 cadenas ligeras. Las cadenas pesada y ligera comprenden un dominio variable y una parte constante. Un sitio de unión a antígeno consiste del dominio variable de una cadena pesada asociada con el dominio variable de una cadena ligera. Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera tienen la misma estructura general. Más particularmente, las características de unión a antígeno de un anticuerpo se determinan esencialmente por 3 regiones específicas en el dominio variable de las cadenas pesada y ligera que se denominan regiones hipervariables o regiones de determinación de complementariedad (CDR) . Estas 3 regiones hipervariables alternan con 4 regiones de estructura (FR) cuyas secuencias se conservan relativamente y no está directamente implicadas en la unión. Los CDR forman bucles y se mantienen muy cerca las regiones de estructura principal que adoptan en gran medida una conformación de lámina ß. Los CDR de una cadena pesada junto con los CDR de la cadena ligera asociada constituyen esencialmente el sitio de unión a antígeno de la molécula de anticuerpo. La determinación de lo que constituye un FR o una región CDR se hace usualmente al comparar la secuencia de aminoácidos de una serie de anticuerpos producidos en la misma especie. Las reglas generales para identificar las regiones CDR y FR son de conocimiento general de un experto en la técnica y por ejemplo se puede encontrar en el sitio web (www.bioinf.org.uk /abs/) .

En general, se presenta aún una necesidad clara de formas nuevas y mejoradas para inducir la regeneración del tejido neural luego de lesión en el sistema nervioso central del adulto (SNC) .

Resumen de la invención La invención está dirigida a un nuevo anticuerpo humano monoclonal con propiedades superiores para modular la actividad NogoA en experimentos in vitro e in vivo y con una influencia positiva en la regeneración neuronal luego de lesión en el sistema nervioso central del adulto (SNC) . La invención por lo tanto proporciona nuevas moléculas de unión a la proteína NogoA o fragmentos de la misma.

En una realización, la invención por lo tanto proporciona una molécula aislada que comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno que se une específicamente al polipéptido NogoA humano (SEQ ID NO: 2) o NiG humano (SEQ ID NO: 3) , dicho sitio de unión a antígeno comprende:

* en secuencia las regiones hipervariables CDR-H1- 6A3 (SEQ ID NO: 8) , CDR-H2- 6A3 (SEQ ID NO: 9) y CDR-H36A3 (SEQ ID NO: 10) ; y

* en secuencia las regiones hipervariables CDR-L1- 6A3 (SEQ ID NO: 11) , CDR-L2- 6A3 (SEQ ID NO: 12) y CDR-L3- 6A3 (SEQ ID NO: 13) .

En todavía otra realización, la invención proporciona una molécula de unión que comprende:

* por lo menos una cadena pesada de inmunoglobulina o fragmento de la misma que comprende (i) un dominio variable que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO: 8) , CDR-H2- 6A3 (SEQ ID NO: 9) y CDR-H3- 6A3 (SEQ ID NO: 10) y

(ii) la parte constante o fragmento de la misma de una cadena pesada humana; y

* por lo menos una cadena ligera de inmunoglobulina o fragmento de la misma que comprende (i) un dominio variable que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR-L1- 6A3 (SEQ ID NO: 11) , CDR-L2- 6A3 (SEQ ID NO: 12) y CDR-L3- 6A3 (SEQ ID NO: 13) y (ii) la parte constante o fragmento de la misma de una cadena ligera humana.

En otra realización, la molécula de unión de acuerdo con la invención tiene una constante de disociación < 1000nM.

En una realización alternativa de la molécula de unión de la invención, la parte constante o fragmento de la misma de la cadena pesada humana es del tipo y4 y la parte constante o fragmento de la misma de la cadena ligera humana es del tipo κ.

En una realización adicional, la molécula de unión de acuerdo con la invención es un anticuerpo monoclonal humano o quimérico o humanizado.

En todavía otra realización, la molécula de unión de acuerdo con la invención comprende una o más secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO: 4 (IgG1 pesado) , SEQ ID NO: 5 (IgG1 ligero) , SEQ ID NO: 24 (IgG4 pesado) y SEQ ID NO: 25 (IgG4 ligero) .

Adicionalmente, la invención también proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula de unión de acuerdo con la invención.

En ciertas realizaciones, dicho polinucleótido aislado de la invención comprende:

* por lo menos una de las secuencias de polinucleótidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16; o

* por lo menos una de las secuencias de polinucleótidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19.

En realizaciones preferidas, dicho polinucleótido de la invención... [Seguir leyendo]

1. Una molécula aislada que comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno que se une específicamente al polipéptido NogoA humano (SEQ ID NO: 2) o NiG humano (SEQ ID NO: 3) , dicho sitio de unión a antígeno comprende:

* en secuencia las regiones hipervariables CDR-H1- 6A3 (SEQ ID NO: 8) , CDR-H2- 6A3 (SEQ ID NO: 9) y CDR-H36A3 (SEQ ID NO: 10) ; y

* en secuencia las regiones hipervariables CDR-L1- 6A3 (SEQ ID NO: 11) , CDR-L2- 6A3 (SEQ ID NO: 12) y CDR-L3- 6A3 (SEQ ID NO: 13) .

2. La molécula de unión de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende:

* por lo menos una cadena pesada de inmunoglobulina o fragmento de la misma que comprende (i) un dominio variable que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO: 8) , CDR-H2- 6A3 (SEQ ID NO: 9) y CDR-H3- 6A3 (SEQ ID NO: 10) y (ii) la parte constante o fragmento de la misma de una cadena pesada humana; y

* por lo menos una cadena ligera de inmunoglobulina o fragmento de la misma que comprende (i) un dominio variable que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR-L1- 6A3 (SEQ ID NO: 11) , CDR-L2- 6A3 (SEQ ID NO: 12) y CDR-L3- 6A3 (SEQ ID NO: 13) y (ii) la parte constante o fragmento de la misma de una cadena ligera humana.

3. La molécula de unión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la parte constante o fragmento de la misma de la cadena pesada humana es del tipo y4 y la parte constante o fragmento de la misma de la cadena ligera humana es del tipo κ.

4. La molécula de unión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha molécula de unión es un anticuerpo monoclonal humano o quimérico o humanizado.

5. La molécula de unión de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una o más secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO: 4 (IgG1 pesado) , SEQ ID NO: 5 (IgG1 ligero) , SEQ ID NO: 24 (IgG4 pesado) y SEQ ID NO: 25 (IgG4 ligero) .

6. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula de unión de acuerdo con la reivindicación 1.

7. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 6 que comprende:

* por lo menos una de las secuencias de polinucleótidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16; o

* por lo menos una de las secuencias de polinucleótidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19.

8. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 6 o 7.

9. Un sistema de expresión que comprende el vector de expresión de la reivindicación 8, en donde dicho sistema de expresión o parte del mismo es capaz de producir un polipéptido de la reivindicación 1, cuando dicho sistema de expresión o parte del mismo está presente en una célula anfitriona compatible.

10. Una célula anfitriona aislada que comprende el vector de la reivindicación 9.

11. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión de acuerdo con la reivindicación 1, un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 6, un vector de expresión o sistema de expresión de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, respectivamente, o una célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 10, en asociación con por lo menos un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

12. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicha composición es una composición de liberación lenta.

13. Un método para producir la molécula de unión de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende expresar el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 6 en un vector de expresión o sistema de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, respectivamente, por medio de tecnología de ADN recombinante o por medio de síntesis química.