Moléculas de anticuerpos para IL-17 humana.

Una molécula de anticuerpo aislada capaz de unirse a la IL-17A humana,

que comprende un conjunto de CDRs:HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en donde el conjunto de CDRs tienes cero, una o dossustituciones de aminoácido a partir de un conjunto de CDRs en el cual:

HCDR1 es la secuencia de aminoácido sec. con núm. de ident.: 63;

HCDR2 es la secuencia de aminoácido sec. con núm. de ident.: 64;

HCDR3 es la secuencia de aminoácido sec. con núm. de ident.: 65;

LCDR1 es la secuencia de aminoácido sec. con núm. de ident.: 68;

LCDR2 es la secuencia de aminoácido sec. con núm. de ident.: 69; y

LCDR3 es la secuencia de aminoácido sec. con núm. de ident.: 70; las sustituciones se escogen de:

(a) una HCDR1 en donde el residuo de Kabat 31 es Ser, Ala, Gly, Thr o Cys y el residuo de Kabat 32 es Tyr;

(b) una HCDR2 en donde el residuo de Kabat 58 es Tyr o Phe;

(c) una HCDR3 en donde el residuo de Kabat 96 es un residuo hidrófobo, el residuo de Kabat 97 es un residuohidrófobo y el residuo de Kabat 98 es un residuo cíclico;

(d) una HCDR3 en donde el residuo de Kabat 96 es un residuo hidrófobo seleccionado de Leu, Ile, Val, Ala orPhe, el residuo de Kabat 97 es un residuo hidrófobo y el residuo de Kabat 98 es un residuo cíclico;

(e) una HCDR3 en donde el residuo de Kabat 96 es un residuo hidrófobo, el residuo de Kabat 97 es un residuohidrófobo seleccionado de Ile, Leu, Val, Ala o Phe; o

(f) una HCDR3 en donde el residuo de Kabat 96 es un residuo hidrófobo, el residuo de Kabat 97 es un residuohidrófobo y el residuo de Kabat 98 es un residuo cíclico seleccionado de His, Trp o Phe.

Moléculas de anticuerpos para la IL-17 humana.

Esta invención se relaciona con miembros de unión para la interleucina 17 (IL-17, además conocida como IL-17A) , especialmente moléculas de anticuerpos, y su uso terapéutico por ejemplo en el tratamiento de trastornos asociados con la IL-17 tal como la artritis reumatoide.

La IL-17A es una citocina derivada de las células-T, la cual tiene actividades pro-inflamatorias pleiotrópicas. In vitro, la IL17A regula la producción de mediadores inflamatorios de fibroblastos y sinoviocitos, puede sinergizar con otras citocinas pro-inflamatorias, y puede promover la degradación del cartílago y la resorción osteoclástica del hueso.

La IL-17A es un homodímero que consiste de dos cadenas de 155 aminoácidos. Cada cadena polipeptídica incluye un péptido N-terminal de 23 aminoácidos el cual se escinde para producir un polipéptido maduro de 132 residuos. La IL-17A se une a y ejerce su efecto a través de la activación de los receptores A y C de la IL-17 (Toy y otros 2006) . Existen cinco homólogos de la IL-17A, designados IL-17B a IL-17F, todos con papeles biológicos divergentes y distintos. Los números de acceso del Swissprot para los homólogos de la IL-17 son: IL-17B Q9UHF5; IL-17C Q96P0M4; IL-17D Q8TAD2; IL-17E Q9H293; IL-17F Q96PD4. La IL-17B y la IL-17C tienen una amplia expresión en los tejidos con el origen celular de las proteínas desconocido, aunque se pueden encontrar transcritos de IL-17B a altos niveles en el sistema nervioso (Moore y otros 2002) . La IL-17B y la IL-17C pueden inducir TNFa a partir de la línea celular de monocitos THP-1 (Li y otros 2000) , e inducir neutrofilia cuando se inyectan en modelos de ratón (Shi y otros 2000) . La IL-17D se detecta en múltiples tejidos y se expresa en células T CD4 + en reposo y en células B CD19+ (Starnes y otros 2002) . La IL-17E (IL-25) produce respuestas de tipo Th2 tales como hiperreactividad de las vías respiratorias y eosinofilia y tiene propiedades distintas a los otros miembros de la familia (Fort y otros 2001) . La IL-17F existe como dos isoformas y exhibe la mayor homología con la IL-17A (55 y 40% de homología) y comparte muchas propiedades funcionales similares tales como la inducción de neutrofilia en el pulmón y la inducción de citocinas pro-inflamatorias que incluyen IL-8 (Hymowitz y otros 2001; Hurst y otros 2002, Oda y otros. 2005) . Los miembros de la familia de la IL-17 pueden tener un papel en la inmunidad innata y adaptativa por lo tanto un anticuerpo dirigido solamente a la IL-17A asegurará que los efectos específicos de la señalización de la IL-17A se supriman en áreas donde se expresa la IL-17A.

La unión entre los miembros de la familia y la familia del receptor de la IL-17 no se comprenden totalmente. Se conoce que la IL-17E señaliza a través del IL-17RB aunque la IL-17B también se informó que se une con una afinidad más baja. (Lee y otros 2001) . La IL-17A se informó que se une al IL-17RC (IL-17RL) adicionalmente al IL-17RA y similarmente a la IL-17F comparte la unión a estos receptores (Toy y otros 2006, Kuestner y otros. 2005) . Existen receptores adicionales, IL-17RD y IL-17RE aunque sus ligandos endógenos todavía tienen que identificarse. Existen múltiples variantes de empalme para la IL-17RC y la IL-17RD (Haudenschild y otros. 2002; Haudenschild y otros. 2006; Moseley y otros. 2003) .

La unión de la IL-17A a su receptor es probable que induzca polimerización del receptor lo que resulta en su activación. La activación del IL-17RA por la IL-17A activa un número de rutas de señalización pro-inflamatorias tales como las rutas de la proteína quinasa regulada por señales extracelulares (ERK1/2) , la quinasa terminal c-jun (JNK) y la quinasa MAP p38. La activación de estas rutas desencadena cambios en los niveles de expresión de una variedad de genes y proteínas, a través de mecanismos que no están completamente definidos.

La IL-17A se secreta primariamente por las células T CD4+ y T CD8+ (Lubberts y otros. 2001) . La IL-17A, como su ARN o proteína intracelular, además se detectó en neutrófilos, eosinófilos y monocitos de sangre humana. (Molet y otros. 2001; Ferretti y otros. 2003) . La IL-6 y el TGFº se implicaron recientemente en la diferenciación de células T vírgenes en células T productoras de IL-17 (Betteli y otros. 2006) , mientras dos citocinas adicionales implicadas en la artritis reumatoide, la IL-15 y la IL-23, regulan la liberación de la IL-17A de los linfocitos T.

La IL-17A regula ascendentemente la producción de citocinas inflamatorias y la producción de prostaglandinas de los fibroblastos sinoviales, aumenta la producción de MMP de los fibroblastos sinoviales y los condrocitos articulares y puede jugar un papel en la resorción osteoclásticas de los huesos. En el contexto del entorno inflamatorio en el tejido de la artritis reumatoide (RA) , la IL-17A puede tener un papel particular al sinergizar con otras citocinas pro-inflamatoria notablemente el TNF-a y la IL-1º.

Varias líneas de evidencia sugieren un importante papel para la IL-17 en la patogénesis de la artritis reumatoide (RA) . La IL17A funcional se secretó espontáneamente por 16/18 explantes sinoviales de RA en comparación a 2/12 explantes OA y 0/3 explantes sinoviales normales. La inmunotinción del sinovio de RA reveló células productoras de IL-17A en el área rica en células T (Chabaud y otros. 1999) . El nivel de IL-17A en el suero de pacientes de RA es elevado en comparación con sueros controles normales (Cho y otros. 2004) .

Se mostró que la IL-17A estimula la liberación de una variedad de citocinas pro-inflamatorias. La IL-17A, algunas veces al actuar en sinergia con otras citocinas, aumenta la producción de IL-1, IL-6, y LIF de fibroblastos sinoviales. (Katz y otros. 2001; Chabaud y otros. 1998) . Además, se mostró que la IL-17A regula ascendentemente la expresión de COX-2 en células inflamatorias.

La IL-17A induce la expresión del gen COX-2 en condrocitos, fibroblastos sinoviales y macrófagos humanos y en explantes sinoviales humanos. (por ejemplo Faour y otros. 2003; Le Grand y otros. 2001) . La IL-17A recombinante regula ascendentemente la expresión de COX-2 por los sinoviocitos y aumenta la expresión de COX-2 por los sinoviocitos estimulada por TNFa (Stamp y otros., 2004) .

Adicionalmente a estas actividades pro-inflamatorias "clásicas", la IL-17A además produce otros efectos en las articulaciones de RA tales como promover la degradación del cartílago. Se mostró además que la IL-17 participa en la regulación ascendente de MMPs e impacta en la degradación del cartílago. La IL-17A aumenta la producción espontánea de MMP1 por los sinoviocitos de RA humana. La IL-17A coordinadamente regula ascendentemente los genes de MMP3, MMP13 y ADAMTS4 en condrocitos articulares bovinos (Sylvester y otros. 2004) . La IL-17A en un potente inductor de la descomposición de la matriz y un inhibidor de la síntesis de la matriz en explantes de cartílago articular (Cai y otros 2001) . Un mecanismo por el cual la IL-17A suprime la síntesis de la matriz por condrocitos articulares es a través del aumento de la producción de NO (Lubberts y otros. 2000) . La IL-17A adenoviral inyectada en la articulación de la rodilla de ratones inmunizados con colágeno de tipo II acelera la aparición, agrava la inflamación sinovial y aumenta la destrucción de la articulación en este sitio. (Lubberts y otros. 2001) .La IL-17A puede además participar en la resorción osteoclástica de los huesos en R.A. (Kotake y otros. 1999) .

Un aspecto importante de la biología de la IL-17A es su habilidad para sinergizar con otras citocinas. Por ejemplo, la IL-17A aumenta la síntesis de IL-1, IL-6 e IL-8 inducida por TNF-a en fibroblastos sinoviales (Katz y otros. 2001) . Además, en la línea celular osteoblástica, MC-3T3, la IL-17 y el TNF-a exhiben una potente sinergia al mediar la secreción de IL-6 (Ruddy y otros. 2004) . La IL-17A aumenta la producción de IL-6 y LIF inducida por IL-1 por los sinoviocitos de RA (Chabaud y otros. 1998) .

El papel de la IL-17A en RA se confirma más aun por evidenciasin vivo a partir de modelos animales de la enfermedad. La sobre-expresión de IL-17A induce daño en el cartílago en la artritis inducida por la pared celular de estreptococo (SCW) en ratones deficientes en IL-1 (Koenders y otros. 2005b) . En el modelo de la artritis inducida por colágeno (CIA) , la sobreexpresión de IL-17A aumenta la artritis (Chabaud & Miossec 2001) . Además, la CIA se suprime en ratones deficientes de IL17A o en ratones tratados con un Acm anti-IL-17 (Nakae y otros. 2003; Lubberts y otros. 2001; Lubberts y otros 2004) .

Adicionalmente a su papel en RA, la actividad de la IL-17A se asoció con un número de otras... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de anticuerpo aislada capaz de unirse a la IL-17A humana, que comprende un conjunto de CDRs: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en donde el conjunto de CDRs tienes cero, una o dos sustituciones de aminoácido a partir de un conjunto de CDRs en el cual:

HCDR1 es la secuencia de aminoácido sec. con núm. de ident.: 63; HCDR2 es la secuencia de aminoácido sec. con núm. de ident.: 64; HCDR3 es la secuencia de aminoácido sec. con núm. de ident.: 65; LCDR1 es la secuencia de aminoácido sec. con núm. de ident.: 68; LCDR2 es la secuencia de aminoácido sec. con núm. de ident.: 69; y LCDR3 es la secuencia de aminoácido sec. con núm. de ident.: 70; las sustituciones se escogen de:

(a) una HCDR1 en donde el residuo de Kabat 31 es Ser, Ala, Gly, Thr o Cys y el residuo de Kabat 32 es Tyr;

(b) una HCDR2 en donde el residuo de Kabat 58 es Tyr o Phe;

(c) una HCDR3 en donde el residuo de Kabat 96 es un residuo hidrófobo, el residuo de Kabat 97 es un residuo hidrófobo y el residuo de Kabat 98 es un residuo cíclico;

(d) una HCDR3 en donde el residuo de Kabat 96 es un residuo hidrófobo seleccionado de Leu, Ile, Val, Ala or Phe, el residuo de Kabat 97 es un residuo hidrófobo y el residuo de Kabat 98 es un residuo cíclico;

(e) una HCDR3 en donde el residuo de Kabat 96 es un residuo hidrófobo, el residuo de Kabat 97 es un residuo hidrófobo seleccionado de Ile, Leu, Val, Ala o Phe; o

(f) una HCDR3 en donde el residuo de Kabat 96 es un residuo hidrófobo, el residuo de Kabat 97 es un residuo hidrófobo y el residuo de Kabat 98 es un residuo cíclico seleccionado de His, Trp o Phe.

2. Una molécula de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una afinidad para unirse a la IL-17A humana madura que tiene una secuencia de aminoácido sec. con núm. de ident.: 198 que es más que 10-veces mayor que para unir la IL-17A humana mutante que tiene la secuencia de aminoácido sec. con núm. de ident.: 201, en donde la afinidad es Kd calculada a partir del índice de constantes de velocidad kd1/ka1 determinado por resonancia de plasmones superficiales usando un modelo de datos de analito bivalente.

3. Una molécula de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la molécula de anticuerpo no se une a la IL-17A humana mutante que tiene la secuencia de aminoácido sec. con núm. de ident.:

201.

4. Una molécula de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde

(a) la unión de la molécula de anticuerpo a IL-17A humana no se inhibe en más del 50% por 1 µM de ninguna de las IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E o IL-17F en un ensayo de competencia de epítopos por medio del uso de la IL-17A etiquetada a una concentración igual a la Kd de la interacción de la molécula de anticuerpo con la IL-17A humana, en donde dicha Kd se calcula a partir de la relación de constantes de velocidad kd1/ka1 según se determinó por la resonancia de plasmones superficiales por medio del uso de un modelo de datos de analito bivalente;

(b) la molécula de anticuerpo tiene una afinidad por la IL-17A de cinomolgo que es menos de 5-veces diferente de su afinidad por la IL-17A humana, en donde la afinidad es Kd calculatada a partir de la relación de constantes de velocidad kd1/ka1 según se determinó por la resonancia de plasmones superficiales por medio del uso de un modelo de datos de analito bivalent; o

(c) la IC50 de la molécula de anticuerpo en un ensayo de células HT1080 de liberación de IL-6 en respuesta a 1 nM IL-17A humana difiere en no más de 10-veces a partir de la IC50 de la molécula de anticuerpo en un ensayo de células HT1080 de liberación de IL-6 en respuesta a 1 nM de IL-17A de cinomolgo.

5. Una molécula de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende:

(a) una LCDR1 en donde el residuo de Kabat 31 es Tyr o Phe y el residuo de Kabat 32 es Tyr o Phe; o

(b) una LCDR3 en donde el residuo de Kabat 91 es Tyr y el residuo de Kabat 93 es Pro, hidroxiprolina, His o 3-metilhistidina.

6. Una molécula de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende un conjunto de CDRs: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en donde:

(a) el residuo de Kabat 31 de HCDR1 es Ser, Ala, Gly, Thr o Cys; el residuo de Kabat 32 de HCDR1 es Tyr; el residuo de Kabat 58 of HCDR2 es Tyr o Phe; el residuo de Kabat 96 of HCDR3 es un residuo hidrófobo; el residuo de Kabat 97 of HCDR3 es un residuo hidrófobo; el residuo de Kabat 98 of HCDR3 es un residuo cíclico; el residuo de Kabat 31 of LCDR1 es Tyr o Phe; el residuo de Kabat 32 of LCDR1 es Tyr o Phe; en el residuo de Kabat 91 de LCDR3 es Tyr; y el residuo de Kabat 93 de LCDR3 es Pro, hidroxiprolina, His o 3-metilhistidina.

(b) la molécula de anticuerpo comprende una HCDR3 en donde el residuo de Kabat 98 es His;

(c) la molécula de anticuerpo comprende una LCDR3 en donde el residuo de Kabat 93 es Pro;

(d) el residuo de Kabat 31 de HCDR1 es Ser; el residuo de Kabat 32 de HCDR1 es Tyr; el residuo de Kabat 58 de HCDR2 es Tyr; el residuo de Kabat 96 de HCDR3 es Leu; el residuo de Kabat 97 of HCDR3 es Ile; el residuo de Kabat 98 of HCDR3 es His; el residuo de Kabat 31 de LCDR1 es Tyr; el residuo de Kabat 32 de LCDR1 es Tyr; en el residuo de Kabat 91 de LCDR3 es Tyr; y el residuo de Kabat 93 de LCDR3 es Pro;

(e) la molécula de anticuerpo comprende una HCDR3 secuencia en donde HCDR3 es sec. con núm. de ident.: 65; o

(f) la molécula de anticuerpo comprende una LCDR3 secuencia en donde LCDR3 es sec. con núm. de ident.:

70.

7. Una molécula de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde

(a) la molécula de anticuerpo tiene una IC50 de no más que 1 nM según se determinó en un ensayo de células HT1080 de liberación de IL-6 en respuesta a 1 nM de IL-17A humana;

(b) lae molécula de anticuerpo tiene una IC50 de no más que 0.5 nM según se determinó en un ensayo de células HT1080 de liberación sinérgica de IL-6 en respuesta a 125 pM IL-17A humana y 25 pM TNFa;

(c) la molécula de anticuerpo tiene una Kd para la IL-17A humana menos de 2.5 nM calculada a partir de la relación de constantes de velocidad kd1/ka1 según se determinó por la resonancia de plasmones superficiales por medio del uso de un modelo de datos de analito bivalente; o

(d) la molécula de anticuerpo tiene una IC50 de no más que 1 nM medida en un ensayo de células HT1080 que mide la liberación de IL-6 en respuesta a 1 nm de IL-17A humana, y en donde dicha IC50 difiere en no más de 10-veces de la IC50 de la molécula de anticuerpo según se midió en un ensayo de células HT1080 que mide la liberación de IL-6 en respuesta a 1 nM de IL-17A de cinomolgo.

8. Una molécula de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la molécula de anticuerpo comprende un dominio VH de anticuerpo y un dominio VL de anticuerpo, en donde la molécula de anticuerpo comprende un conjunto de CDRs: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en donde el dominio VH comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3 y las regiones marco de cadena pesada FR1, FR2, FR3 y FR4, y el dominio VL comprende LCDR1, LCDR2 y LCDR3 y regiones marco de cadena ligera FR1, FR2, FR3 y FR4.

9. Una molécula de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el dominio VH de anticuerpo tiene la secuencia de aminoácido de dominio VH mostrada en la sec. con núm. de ident.: 62.

10. Una molécula de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el dominio VL de anticuerpo tiene la secuencia de aminoácido de dominio VL mostrada en la sec. con núm. de ident.: 176.

11. Una molécula de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde la molécula de anticuerpo comprende un dominio VH con la secuencia de aminoácido de dominio VH mostrada en la sec. con núm. de ident.: 62 y un dominio VL con la secuencia de aminoácido de dominio VL mostrada en la sec. con núm. de ident.: 176.

12. Una molécula de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 11, la cual es una IgG.

13. Una composición que comprende una molécula de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

14. Una composición que comprende una molécula de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para usar en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal por cirugía o terapia.

15. Una composición de acuerdo con la reivindicación 14 para usar en el tratamiento de un trastorno asociado con la IL-17A, en donde el trastorno es un trastorno inflamatorio; o en dondeel trastorno es artritis reumatoide, osteoartritis, pérdida ósea, hipersensibilidad de las vías aéreas, un trastorno desmielinizante, soriasis, hipersensibilidad dérmica , rechazo agudo al trasplante, rechazo al aloinjerto, enfermedad del huésped contra el injerto, esclerosis sistémica, lupus eritematoso sistémico, una enfermedad inflamatoria del intestino autoinmune, un trastorno inflamatorio urológico, una enfermedad cardiovascular, vasculitis, una fiebre periódica, un transtorno del metabolismo de la glucosa, una enfermedad pulmonar, un cáncer, peridontitis, queratitis estromal herpética, una alergia, artritis reactiva, dolor inflamatorio, una espondiloartropatía, septicemia, choque séptico o endotóxico, meningitis, trauma quirúrgico, un transtorno autoinmune hematológico, enfermedad de Alzheimer, sarcoidosis, cirrosis, hepatitis, glomerulonefritis o dislipidemia.

16. Una composición de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el transtorno es la artritis reumatoide.

17. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica: una molécula de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

18. Una célula huésped transformada in vitro con ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 17.

19. Un método para producir una molécula de anticuerpo, que comprende cultivar células huésped de acuerdo con la reivindicación 18 bajo condiciones para la producción de la molécula de anticuerpo.

20. Un método para producir una composición que comprende una molécula de anticuerpo, que comprende:

producir una molécula de anticuerpo por el método de la reivindicación 19; y formular la molécula de anticuerpo en una composición que comprende al menos un componente adicional.

Figura 1

Figura 2