Modulación de la expresión de la 11beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa de tipo 1 para el tratamiento de enfermedades oculares.

Uso de un ANip que selecciona como diana a la 11beta-hidroxiesteroidedeshidrogenasa de tipo 1 (11 beta-HSD1) y capaz de inhibir la expresión de la11beta-HSD1 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de unaafección de ojo caracterizada por una presión intraocular alterada,

en la quedicho medicamento se formula para una administración tópica en la superficiede la córnea de un paciente y es capaz de inhibir la expresión de la 11 betahidroxiesteroidedeshidrogenasa 1 en el ojo del paciente.

CAMPO DE INVENCIÓN

La presente invención se dirige a métodos y composiciones para el tratamiento y/o la prevención de afecciones oculares relacionadas con altos niveles de expresión o de actividad de la 11beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa de tipo 1 (en adelante, 11beta-HSD1) ; en particular, pero no de manera exclusiva a los tratamientos de glaucoma. En modos de realización preferidos, la invención se dirige al uso de tecnología ARN de interferencia (ARNi) para disminuir la expresión de la 11 beta-HSD1.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El glaucoma es una de las principales causas de ceguera. El glaucoma produce aproximadamente el 15% de los casos de ceguera mundial. El tipo más común, el glaucoma de ángulo abierto primario, tiene una prevalencia de 1/200 en la población general mayor de 40 años. El glaucoma se ha definido simplemente como el proceso de destrucción de tejido ocular causado por una elevación continua de la presión intraocular (PIO) superior a los límites fisiológicos normales. Aunque varias etiologías pueden verse implicadas en el complejo del glaucoma, un factor determinante en la selección del tratamiento es la cantidad de cambios primarios y/o inducidos en la presión del ángulo iridocorneal.

Las terapias actuales incluyen tratamientos o cirugías destinados a reducir dicha presión, aunque se desconocen los mecanismos fisiopatológicos por los que la PIO elevada conduce a un daño neuronal en el glaucoma. La supresión médica de una PIO elevada puede intentarse mediante el uso de cuatro tipos de fármacos: (1) supresores de la formación de humor acuoso (tales como inhibidores de la anhidrasa carbónica, agentes bloqueadores beta-adrenérgicos y agonistas de adrenoreceptor alfa2) ; mióticos (tales como parasimpaticomiméticos, incluidos inhibidores colinérgicos y anticolinérgicos) ; (3) potenciadores de flujo uveoescleral; y (4) agentes hiperosmóticos (que producen un gradiente de presión osmótica sobre la barrera sanguínea/acuosa del epitelio ciliar) . Una quinta categoría de fármacos, los agentes neuroprotectores, está emergiendo como un complemento importante a la terapia médica, que incluye, por ejemplo, inhibidores de la NO-sintetasa (NOS) , antagonistas de los aminoácidos excitatorios, antagonistas de receptores de glutamato, inhibidores de apoptosis y bloqueadores del canal del calcio.

Reseñas de diferentes trastornos oculares pueden encontrarse en las siguientes referencias: Bunce et al., 2005, Associations between the deletion polymorphism of the angiotensin 1-converting enzyme gene and ocular signs of primar y open-angle glaucoma. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol.; 243 (4) :294; Costagliola et al., 2000, Effect of oral losartan potassium administration on intraocular pressure in normotensive and glaucomatous human subjects. Exp Eye Res 71 (2) :167; Costagliola et al., 1995, Effect of oral captopril (SQ 14225) on intraocular pressure in man. Eur J Ophthalmol., 5 (1) :19; Cullinane et al., 2002, Renin-angiotensin system expression and secretor y function in cultured human ciliar y body non-pigmented epithelium. Br J Ophthalmol., 86 (6) :676; Sakaguchi et al., 2002, Chymase and angiotensin converting enzyme activities in a hamster model of glaucoma filtering surger y . Curr Eye Res. 24 (5) :325; Shah et al., 2000, Oculohypotensive effect of angiotensin-converting enzyme inhibitors in acute and chronic models of glaucoma. J Cardiovasc Pharmacol., 36 (2) :169, y Wang et al., 2005, Effect of CS-088, an angiotensin AT1 receptor antagonist, on intraocular pressure in glaucomatous monkey target RNAeyes. Exp Eye Res., 80 (5) :629.

La interferencia por ARN se refiere al proceso de silenciamiento génico postranscripcional de una secuencia específica transmitida por ARN interferente pequeño (ARNip) . Tras el descubrimiento de este fenómeno en plantas a principios de la década de los 90, Andy Fire y Craig Mello demostraron que el ARN bicatenario (ARNbc) inhibía selectiva y específicamente la expresión génica de un modo muy eficiente en el nematodo Caenorhabditis elegans (Fire et al., 1998, Potent and specific genetic interference by double stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 391:806) . La secuencia de la primera hebra (ARN con sentido) coincidió con la de la correspondiente región del ARN mensajero diana (ARNm) . La segunda hebra (ARN antisentido) era complementario al ARNm. El ARNbc resultante resultó ser diferentes órdenes de magnitud más eficaz que las correspondientes moléculas de ARN monocatenarias (en particular, el ARN antisentido) .

El proceso de interferencia por ARN (ARNi) empieza cuando la enzima, DICER, encuentra ARNbc y lo corta en fragmentos que reciben el nombre de ARN interferente pequeño (ARNip) . Esta proteína pertenece a la familia de nucleasas RNasa III. Un complejo de proteínas reúne estos residuos de ARN y utiliza su código como guía para buscar y destruir cualquier ARN en la célula con una secuencia de apareamiento, como ARNm diana (véase: Bosher & Labouesse, 2000, RNA interference: genetic wand and genetic watchdog. Nat Cell Biol, 2000, 2 (2) :E31, y Akashi et al., 2001, Suppression of gene expression by RNA interference in cultured plant cells. Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 11 (6) :359) .

En intentos por utilizar ARNi para el silenciamiento génico, se reconoció que las células de mamífero han desarrollado diversos mecanismos protectores contra infecciones virales que podrían dificultar la utilización de este enfoque. De hecho, la presencia de niveles extremadamente bajos de ARNbc viral da como resultado una respuesta interferón, que ocasiona una supresión de la traducción no específica global, lo que, a su vez, provoca apoptosis (Williams, 1997, Role of the doublestranded RNA-activated protein kinase (PKR) in cell regulation. Biochem Soc Trans, 25 (2) :509; Gil & Esteban, 2000, Induction of apoptosis by the dsRNA-dependent protein kinase (PKR) : mechanism of action. Apoptosis, 5 (2) :107-14) .

En 2000, se declaró que el ARNbc inhibía específicamente 3 genes en el oocito de ratón y en el embrión en etapa temprana. No se observó detención translacional ni, por tanto, una respuesta de proteína-cinasa R, puesto que los embriones continuaron desarrollándose (Wianny & Zernicka-Goetz, 2000, Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol, 2 (2) :70) . La investigación en Ribopharma AG (Kulmbach, Alemania) demostró la funcionalidad de ARNi en células de mamíferos, utilizando ARNbc pequeño (20-24 pares de bases) para desactivar genes en células humanas sin iniciar la respuesta de la fase aguda. Estos resultados se confirmaron por experimentos similares llevados a cabo por otros grupos de investigación. (Elbashir et al., 2001, RNA interference is mediated by 21and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev, 15 (2) :188; Caplen et al., 2001, Specific inhibition of gene expression by small double stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 9742) . Sometido a ensayo en una variedad de líneas de células de ratón y humanas de cáncer y normales, se determinó que el ARN de horquilla pequeña (ARNhp) puede silenciar genes con la misma eficacia que sus homólogs de ARNip (Paddison et al, 2002, Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev, 16 (8) :948) . Recientemente, se demostró que otro grupo de ARN pequeños (21-25 pares de bases) mediaba la regulación por disminución de la expresión génica. Estos ARN, ARN pequeños regulados temporalmente (ARNtp) , regulan el calendario de la expresión génica durante el desarrollo en Caenorhabditis elegans (para una revisión, véase Banerjee & Slack, Control of developmental timing by small temporal RNAs: a paradigm for RNA-mediated regulation of gene expression. Bioessays, 2002, 24 (2) :119-29 y Grosshans & Slack, 2002, Micro-RNAs: small is plentiful. J Cell Biol,

156 (1) :17) . [0009] Los científicos han utilizado ARNi en diversos sistemas, incluyendo Caenorhabditis elegans, Drosófila, tripanosomas y otros invertebrados. Diversos grupos han presentado recientemente la supresión específica de la biosíntesis de proteínas en diferentes líneas de células de mamífero (en concreto, en células HeLa) demostrando que ARNi es un método de amplia aplicación para el silenciamiento génico in vitro. A partir de estos resultados, ARNi se ha convertido rápidamente en una herramienta bien reconocida para validar (identificar y asignar) la función génica. El ARNi que emplea oligonucleótidos de ARNbc pequeños, aportará una comprensión de la función de los genes que están secuenciados sólo parcialmente.

Como ya he se ha indicado, la PIO se mantiene gracias al equilibrio entre la producción (dependiente... [Seguir leyendo]

1. Uso de un ANip que selecciona como diana a la 11beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa de tipo 1 (11 beta-HSD1) y capaz de inhibir la expresión de la 11beta-HSD1 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una afección de ojo caracterizada por una presión intraocular alterada, en la que dicho medicamento se formula para una administración tópica en la superficie de la córnea de un paciente y es capaz de inhibir la expresión de la 11 betahidroxiesteroide deshidrogenasa 1 en el ojo del paciente.

2. El uso de la reivindicación 1, en la que se selecciona la afección del ojo de entre el grupo que comprende glaucoma, infección, inflamación, uveítis, retinopatía diabética y la expresión de enfermedades sistemáticas.

3. El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en las que la afección del ojo sea un glaucoma.

4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en las que ANip es ARNip.

5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en las que ANip comprende uno o más oligonucleótidos modificados.

6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en las que se utilizan una pluralidad de especies de ANip.

7. El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en las que el gen diana es la 11 beta-HSD1, y el ANip que selecciona como diana a una secuencia seleccionada de la SEC ID Nº: 1 a la SEC ID Nº: 61 o a una secuencia que comprende de la SEC ID Nº: 1 a la SEC ID Nº: 61.

8. El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en las que las moléculas de ANip de la invención comprenden secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo de la SEC ID Nº 62 a la SEC ID Nº122.

9. Un compuesto de ANip aislado que selecciona como diana a la 11beta-HSD1 y capaz de inhibir la expresión de la 11 beta-HSD1, en el que el compuesto de ANip comprende una secuencia complementaria a una secuencia de nucleótidos seleccionada de la SEC ID Nº: 1 a la SEC ID Nº: 61, para su uso en el tratamiento de una afección de ojo caracterizada por una presión intraocular alterada mediante la administración tópica del ANip en la superficie de la córnea.

10. Un compuesto de ANip aislado que selecciona como diana a la 11beta-HSD1 y capaz de inhibir la expresión de la 11beta-HSD1, en el que el compuesto de ANip comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de la

SEC ID Nº 62 a la SEC ID Nº 122, para su uso en el tratamiento de una afección de ojo caracterizada por una presión intraocular alterada mediante la administración tópica del ANip en la superficie de la córnea.

11. El compuesto de ANip aislado para el uso según la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en las que el ANip comprende un oligonucleótido modificado.

12. El compuesto de ANip aislado para el uso de cualquiera de las reivindicaciones de la 9 a la 11, que además comprende salientes 3’.

Figura 1

Número de acceso Definición

NM_005525 Hidroxiesteroide (11-beta) deshidrogenasa 1 (HSD11B1) de homo sapiens, variante de transcripción 1; ARNm

NM_181755 Hidroxiesteroide (11-beta) deshidrogenasa 1 (HSD11B1) de homo sapiens, variante de transcripción 2; ARNm

Figura 4.

% de PIO

Solución salina solución salina

TIEMPO (horas)

DÍAS