Métodos de diagnóstico de enfermedades de neuronas motoras.

Un método para diagnosticar una enfermedad de neuronas motoras (MND),

comprendiendo el método analizaruna actividad o una expresión de miARN-9 o miARN-9* en una muestra de un sujeto humano que lo necesita, en elque una regulación negativa de dicha actividad o dicha expresión de dicho miARN-9 o miARN-9* es indicativa de laMND.

Métodos de diagnóstico de enfermedades de neuronas motoras Campo y antecedentes la invención La presente invención, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a métodos de diagnóstico y tratamiento de enfermedades de neuronas motoras y, más particularmente, pero no exclusivamente, a la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) .

Las enfermedades de neuronas motoras (MND) pertenecen a un grupo de trastornos neurológicos atribuidos a la destrucción de neuronas motoras del sistema nervioso central y a cambios degenerativos en la vía de la neurona motora. Dichas enfermedades son diferentes de otras enfermedades neurodegenerativas, que incluyen enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, atrofia olivopontocerebelosa, etc, que son causadas por la destrucción de neuronas que no son las neuronas motoras. Por lo general, las MND son trastornos degenerativos progresivos, que afectan a los nervios en las partes superior e inferior del cuerpo. Generalmente, las MND se descubren en la madurez. Los síntomas pueden incluir dificultad para tragar, debilidad en las extremidades, dificultad para hablar, alteración de la marcha, debilidad facial y calambres musculares. La respiración se puede ver afectada en las últimas etapas de estas enfermedades. La causa o causas de la mayoría de las MND no se conocen, pero los factores ambientales, tóxicos, virales o genéticos son todos sospechosos.

Las neuronas motoras, que incluyen las neuronas motoras superiores y las neuronas motoras inferiores, afectan a los músculos voluntarios, estimulándolos para que se contraigan. Las neuronas motoras superiores se originan en la corteza cerebral y envían fibras a través del tronco cerebral y la médula espinal, y están implicadas en el control de las neuronas motoras inferiores. Las neuronas motoras inferiores están situadas en el tronco del encéfalo y la médula espinal y envían fibras a los músculos. Las enfermedades de las neuronas motoras inferiores son enfermedades que implican menor degeneración de las neuronas motoras. Cuando una neurona motora inferior se degenera, las fibras musculares que normalmente activa se desconectan y no se contraen, causando debilidad muscular y disminución de los reflejos. La pérdida de cualquiera de los tipos de neuronas da como resultado debilidad, atrofia muscular (debilidad) y debilidad indolora que son las características clínicas de la MND.

La Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) es una enfermedad mortal de las neuronas motoras caracterizada por una pérdida de células piramidales en la corteza motora cerebral (es decir, células gigantes de Betz) , neuronas motoras espinales anteriores y neuronas motoras del tronco encefálico, y degeneración de las mismas en células piramidales. La ELA muestra, desde un aspecto clínico, signos tanto de las neuronas motoras superiores como de las neuronas motoras inferiores, y muestra un rápido deterioro clínico después de la aparición de la enfermedad, lo que conduce de este modo a la muerte en unos pocos años.

Al igual que muchas otras enfermedades de las neuronas motoras, solo un pequeño porcentaje (aproximadamente un 10 %-15 %) de la ELA se hereda. La epidemiología genética de la ELA ha revelado por lo menos seis localizaciones cromosómicas responsables de la herencia de la enfermedad (de ALS1 a ALS6) . Entre éstas, se han identificado tres genes. El primero fue identificado en 1993 como el gen superóxido dismutasa de Cu/Zn citosólica (SOD-1) que representa un 20 % de la forma dominante autosómica de la ELA (Rosen y col., 1993, Nature, 4 de marzo de 1993; 362 (6415) : 59-62) . El descubrimiento de esta causa genética principal de la ELA ha proporcionado una base para generar modelos de ratón para esta enfermedad. Estos modelos son útiles para someter a ensayo terapias que podrían ayudar en el tratamiento de la ELA.

El segundo se denominó Alsin, un factor de intercambio potencial de nucleótidos de guanina (GEF) responsable de la forma recesiva juvenil de ELA. El tercero es ALS4 que codifica para un dominio de ADN/ARN helicasa que contiene una proteína llamada Senataxina identificada por estar vinculada a la forma dominante autosómica de la ELA juvenil. Más recientemente, se informó que una mutación en la proteína de membrana asociada a vesículas/proteína B de membrana asociada a sinaptobrevina (VAPB) en un nuevo locus llamado ELA8, se asocia con una forma atípica de la ELA.

El riluzol es el único fármaco aprobado para la ELA en Estados Unidos y Japón. El riluzol se desarrolló originalmente como un anticonvulsivo que inhibe la liberación de glutamato y en varios ensayos clínicos se ha informado que solo muestra una ligera eficacia para la supervivencia de los pacientes con ELA (Rowland L P y Shneider N A, 2001, N Engl J Med, 344, 1688-1700; y Turner M R y Parton M J, 2001, Semin Neurol 21: 167-175) .

Los micro-ARN (también conocidos como miARN) son miembros de moléculas de ARN de 20 a 24 nucleótidos (nt) de la familia de los ARN pequeños no codificantes. Los micro-ARN fueron identificados en mamíferos, gusanos, moscas de la fruta y plantas y se cree que regulan la estabilidad de sus copias de ARN mensajero diana (ARNm) de una forma específica de tipo tisular y celular. Principalmente, los micro-ARN regulan la estabilidad del ARN mediante la unión a la región 3’ no traducida (UTR en la posición 3’) de los ARNm diana y por lo tanto suprimen la traducción,

o de forma similar a los siARN, uniéndose a y destruyendo copias diana de una forma dependiente de las secuencias.

Se encontró que los micro-ARN estaban implicados en diversas vías de diferenciación celular. Por ejemplo, se encontró que miR-181 se expresa preferentemente en las células linfoides B y su expresión ectópica en células madre/progenitoras hematopoyéticas conducía a un aumento de la fracción de células de linaje B in vitro e in vivo. Además, se demostró que miR-23 está presente en células NT2 progenitoras neurales humanas diferenciadas, pero no sin diferenciar y que regula un supresor transcripcional en dichas células. Otros investigadores han identificado la generación de moléculas de tipo micro-ARN derivadas de intrones (Id-micro-ARN) de estas regiones como una herramienta para el análisis de la función genética y desarrollo de agentes terapéuticos específicos de genes, y predijeron posibles aplicaciones que incluyen sistemas principales de modulación genética para la regulación del desarrollo, inmunidad intracelular, inactivación de heterocromatina, y evolución del genoma en eucariotas (Lin y Ying, 2004b) .

Los micro-ARN se han visto implicados en diversas enfermedades neurológicas tales como Síndrome del cromosoma X frágil, atrofia muscular espinal (SMA) , parkinsonismo de inicio temprano (síndrome de Waisman) y retraso mental ligado al cromosoma X (MRX3) , así como diversos tipos de cáncer y afecciones precancerosas tales como tumor de WiIm, tumor de células germinales testiculares, leucemia linfocítica crónica (LLC) , leucemia de linfocitos B, linfoma de tejidos colorrectales precancerosos y neoplásicos y de Burkkit [revisado en Gong H, y col., 2004, Mediacl Research Reviews, Publicado online en Wiley InterScience (www.intersciencedotwileydotcom) ].

La Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 20060247193 enseña la administración de más de 100 miARN para el tratamiento de las MND que incluyen la ELA.

La Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 20090246136 enseña la administración de miR-206 y/o miR-1 para el tratamiento de las MND que incluyen la ELA.

Figlewicz y col [Human Molecular Genetics, Volumen 3, 1994] enseña variantes de la subunidad de neurofilamentos pesados que están asociadas con el desarrollo de la ELA.

La técnica anterior relevante adicional incluye la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 20080176766.

Sumario de la invención La presente invención se define con las reivindicaciones.

De acuerdo con la presente invención se proporciona un método para diagnosticar una MND, método que comprende analizar una actividad o expresión de miARN-9 o miARN-9* en una muestra de un sujeto que lo necesita, en el que una regulación negativa de la activitidad o la expresión del miARN-9 o miARN-9* es indicativo de la MND.

De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación se proporciona un kit para diagnosticar una MND que comprende un agente que determina específicamente un nivel de miARN-9 o miARN-9*.

En un ejemplo de la presente invención, el análisis de dicha actividad o expresión de miR-9 o miR-9* se realiza usando una sonda de oligonucleótidos que tiene una secuencia de ácidos nucleicos tal como se establece en las SEC ID Nºs: 3 o 4.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención,... [Seguir leyendo]

1. Un método para diagnosticar una enfermedad de neuronas motoras (MND) , comprendiendo el método analizar una actividad o una expresión de miARN-9 o miARN-9* en una muestra de un sujeto humano que lo necesita, en el

que una regulación negativa de dicha actividad o dicha expresión de dicho miARN-9 o miARN-9* es indicativa de la MND.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho análisis de dicha actividad o expresión de dicho miARN-9 o miARN-9* se realiza usando una sonda de oligonucleótidos que tiene una secuencia de ácidos nucleicos tal como se 10 expone en SEC ID Nº: 3 o 4.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la MND se selecciona entre el grupo que consiste en Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) , esclerosis lateral primaria, atrofia muscular progresiva, parálisis pseudobulbar, parálisis bulbar progresiva, enfermedad de neuronas motoras inferiores y atrofia muscular espinal.

4. El método de la reivindicación 1, en el que dicha muestra comprende una muestra de líquido cerebroespinal (CSF) .

5. El método de la reivindicación 1, en el que dicha muestra comprende una muestra de sangre. 20

6. El método de la reivindicación 1, en el que la MND es ELA.