Método para producir proteínas secretadas.

Un método para producir una a-galactosidasa A humana secretada,

que comprende:

(a) amplificar una secuencia de nucleótidos de a-galactosidasa A en una célula CHO modificada poringeniería genética que expresa a-galactosidasa A y dihidrofolato reductasa (DHFR);

(b) cultivar dicha célula en condiciones en las que la a-galactosidasa A se sobreexpresa dando comoresultado la formación de estructuras cristalinas que contienen a-galactosidasa A humana en vesículaslimitadas por membrana, y en las que dicha a-galactosidasa A se secreta al medio de cultivo celular; y

(c) aislar dicha a-galactosidasa A del medio de cultivo celular,

en el que dicha a-galactosidasa A contiene manosa-6-fosfato, y en el que la célula puede obtenerse por crecimientopor etapas en concentraciones de metotrexato crecientes hasta 1000 mM.

Método para producir proteínas secretadas 1. Introducción La presente invención se refiere a la producción de α-galactosidasa humana biológicamente activa (α-Gal A) que contiene manosa-6-fosfato, que supone la clonación y expresión de la secuencia de codificación genética para α-Gal A en un sistema de expresión de células CHO, el cual proporciona las adecuadas modificaciones posteriores a la traducción y el procesado del producto de expresión.

Se desvelan en la presente memoria ejemplos de trabajo en los que se produjeron niveles elevados de α-Gal A en sistemas de expresión en mamíferos. La enzima α-Gal producida de acuerdo con la invención se puede utilizar para varios fines, incluyendo, pero no estando limitados a, terapia de sustitución enzimática para la enfermedad de Fabr y , procesos industriales que implican la hidrólisis de restos de α-D-galactosilo de glicoconjugados, y para la conversión del antígeno del grupo sanguíneo B en eritrocitos al antígeno del grupo sanguíneo 0.

2. Antecedentes de la invención A comienzos de los años 70, varios investigadores demostraron la existencia de dos isoenzimas de α-galactosidasa denominadas A y B, las cuales hidrolizaban los enlaces α-galactosídicos en 4-MU- y/o r-NP-α-D--galactopiranósidos (Kint, 1971, Arch. Int. Physiol. Biochem. 79: 633-644; Beutler & Kuhl, 1972, Amer. J. Hum. Genet. 24: 237-249; Romeo, et al., 1972, FEBS Lett. 27: 161-166; Wood & Nadler, 1972, Am. J. Hum. Genet. 24: 250-255; Ho, et al., 1972, Am. J. Hum. Genet. 24 : 256-266 ; Desnick, et al., 1973, J. Lab. Clin. Med. 81: 157-171; y Desnick, et al., 1989, en: The Metabolic Basis of Inherited Disease, Scriver, C.R., Beaudet, A.L. Sly, W.S. and Valle, D., eds. pp. 17511796. McGraw Hill, New York) . En tejidos, alrededor del 80-90% de la actividad de α-galactosidasa (α-Gal) total era debida a una isoenzima α-Gal A termolábil, que puede inhibirse por mioinositol, mientras que el resto lo justificaba una α-Gal B, relativamente termoestable. Las dos isoenzimas se podían separar por electroforesis, isoelectroenfoque y cromatografía de intercambio iónico. Después de un tratamiento con neuraminidasa, las migraciones electroforéticas y los valores del pI (punto isoeléctrico) de α-Gal A y B eran similares (Kint, 1971; Arch. Int. Physiol. Biochem. 79: 633-644) , sugiriendo inicialmente que las dos enzimas eran los productos del mismo gen glicosilados de forma diferente. El hallazgo de que las enzimas glicoproteicas purificadas tenían similares propiedades físicas incluyendo el peso molecular de subunidad (~ 46 kDa) , estructuras homodiméricas y composiciones de aminoácidos, también indicaba su afinidad estructural (Beutler & Kulh, 1972, J. Biol. Chem. 47: 7195-7200; Callahan et al., 1973, Biochem. Med. 7: 424-431; Dean et al., 1977, Biochem. Biophys. Res. Comm. 77: 1411-1417; Scram, et al., 1977, Biochim. Biophys. Acta. 482: 138-144; Kusiak, et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 184190 ; Dean, et al., 1979, J. Biol. Chem. 254: 10001-10005 ; and Bishop, et al., 1980, en Enzyme Therapy in Genetic Disease: 2, Desnick, R.J. ed., pp. 17-32, Alan R. Liss, Inc., New York) . Sin embargo, la demostración posterior de que los anticuerpos policlonales frente a α-Gal A o B no presentaban reacción cruzada con la otra enzima (Beutler & Kuhl, 1972, J. Biol. Chem. 247: 7195-7200; y Schram, et al., 1977, Biochim. Biophys. Acta. 482: 138-144) ; de que solamente la actividad α-Gal A era deficiente en hemicigotos con enfermedad de Fabr y (Kint, 1971, Arch. Int. Physiol. Biochem. 79: 633-644; Beutler & Kuhl, 1972, Amer. J. Hum. Genet. 24: 237-249; Romeo, et al., 1972, FEBS Lett. 27: 161-166; Wood & Nadler, 1972, Am. J. Hum. Genet. 24: 250-255; Ho, et al., 1972, Am. J. Hum. Genet. 24: 256-266; Desnick, et al., 1973, J. Lab. Clin. Med. 81: 157-171; y Desnick, et al., 1989, en: The Metabolic Basis of Inherited Disease, Scriver, C.R., Beaudet, A.L. Sly, W.S. and Valle, D., eds. pp. 1751-1796. McGraw Hill, New York; y (Beutler & Kuhl, 1972, J. Biol. Chem. 247 :7195-7200) ; y de que los genes para α-Gal A y B correspondían a diferentes cromosomas (Desnick, et al., 1989, en: The Metabolic Basis of Inherited Disease, Scriver, C.R., Beaudet,

A.L. Sly, W.S. and Valle, D., eds. pp. 1751-1796, McGraw Hill, New York; deGroot, et al., 1978, Hum. Genet. 44: 305312) , claramente demostraban que estas enzimas eran genéticamente distintas.

2.1. La α-Gal A y la enfermedad de Fabr y

En la enfermedad de Fabr y , una enfermedad de almacenamiento en lisosomas que resulta de una deficiente actividad de la α-Gal A, la identificación del defecto enzimático en 1967 (Brady, et al., 1967, N. Eng. J. Med. 276: 1163) condujo a los primeros ensayos terapéuticos in vitro (Dawson et al., 1973, Pediat. Res. 7: 694-690m) e in vivo (Mapes et al., 1970, Science 169:987) de sustitución de α-Gal A, en 1969 y 1970, respectivamente. Estos y posteriores ensayos (Mapes et al., 1970, Science 169: 987; Desnick et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5326; y Brady, et al., 1973, N. Engl. J. Med. 289:9) , demostraron la efectividad bioquímica de la sustitución directa del enzima para esta enfermedad. Se administraron inyecciones repetidas de α-Gal A de plasma y bazo purificadas (100.000 U/inyección) a hemicigotos afectados durante un periodo de cuatro meses (Desnick et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5326) . Los resultados de estos estudios demostraron que (a) el aclaramiento en plasma de la forma de bazo era 7 veces más rápida que la de la forma de plasma (10 min. frente a 70 min.) ; (b) en comparación con la forma de bazo de la enzima, la forma de plasma llevaba a cabo una reducción del substrato en plasma 25 veces más grande durante un periodo de tiempo notablemente más largo (48 horas frente a 1 hora) ; (c) no había evidencia de una respuesta inmunológica a seis dosis de cualquiera de las formas, administradas por vía intravenosa durante una periodo de cuatro meses, a dos hemicigotos afectados; y (d) se obtuvo una evidencia sugestiva que indicaba que el substrato almacenado en tejido se movilizaba hacia el interior de la circulación después de la reducción de la forma de plasma, pero no de la forma de bazo de la enzima. Por lo tanto, la enzima administrada no solo reducía el substrato de la circulación (un sitio principal de acumulación) , sino que también posiblemente movilizaba el substrato previamente almacenado, desde otros depósitos hacia el interior de la circulación, para un posterior aclaramiento. Estos estudios indicaban el potencial para eliminar, o reducir de forma significativa, el almacenamiento glicolipídico patológico mediante una sustitución repetida de enzima.

Sin embargo, no se ha demostrado la efectividad bioquímica y clínica de la sustitución enzimática en la enfermedad de Fabr y , debido a la falta de suficiente enzima humana para dosis adecuadas y una evaluación a largo plazo.

2.2. La enzima α-Gal A

La enzima α-Gal A humana tiene un peso molecular de aproximadamente 101.000 Da. En electroforesis en gel-SDS migra como una única banda de aproximadamente 49.000 Da, indicando que la enzima es un homodímero (Bishop & Desnick, 1981, J. Biol. Chem. 256: 1307) . La enzima α-Gal A se sintetiza como un precursor de 50.500 Da que contiene oligosacáridos fosforilados sensibles a endoglicosidasa H. Este precursor se procesa a una forma madura de aproximadamente 46.000 Da, a los 3-7 días después de su síntesis. Los intermediarios de este procesado no han sido definidos (Lemansky, et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 2062) . Como con muchas enzimas lisosomales, la α-Gal A fija el objetivo hacia los lisosomas vía el receptor de manosa-6-fosfato. Esto se pone de manifiesto por la elevada tasa de secreción de esta enzima en células de mucolipidosis II y en fibroblastos tratados con NH4Cl.

Se ha visto que la enzima contiene 5-15% de hidratos de carbono unidos a Asn (Ledonne, et al., 1983, Arch. Biochem. Biophys. 224: 186) . Se vio que la forma de tejido de esta enzima tenía ~ 52% de un tipo de elevado contenido en manosa y 48% de oligosacáridos de tipo complejo. El tipo elevado en manosa eluía a la vez, en cromatografía en Bio-gel, con Man8-9GlcNAc, mientras que los oligosacáridos tipo complejo eran de dos categorías que contenían 14 y 19-39 unidades de glucosa. Por iso-electroenfoque, se observan muchas formas de esta enzima dependiendo de las fuentes de la enzima purificada (forma de tejido frente a plasma) . Sin embargo, mediante tratamiento con neuraminidasa, se observa una única banda (pI-5, 1) que indica que esta heterogeneidad es debida a los diferentes grados de sialilación (del inglés “sialylation”,... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir una α-galactosidasa A humana secretada, que comprende:

(a) amplificar una secuencia de nucleótidos de α-galactosidasa A en una célula CHO modificada por ingeniería genética que expresa α-galactosidasa A y dihidrofolato reductasa (DHFR) ;

(b) cultivar dicha célula en condiciones en las que la α-galactosidasa A se sobreexpresa dando como resultado la formación de estructuras cristalinas que contienen α-galactosidasa A humana en vesículas limitadas por membrana, y en las que dicha α-galactosidasa A se secreta al medio de cultivo celular; y

(c) aislar dicha α-galactosidasa A del medio de cultivo celular,

en el que dicha α-galactosidasa A contiene manosa-6-fosfato, y en el que la célula puede obtenerse por crecimiento 10 por etapas en concentraciones de metotrexato crecientes hasta 1000 μM.