Método para generación y uso de patrones isotópicos en datos espectrales de masa de organismos simples.

Un método para identificar un analito de una muestra biológica al que un estresante afecta que comprende las etapas de:

a) proporcionar una muestra de organismo biológico compuesto que está compuesto por dos muestras mezcladas de organismos biológicos que son una muestra de control y una muestra experimental, donde dichos organismos de muestra de control se han cultivado en un primer medio nutriente que contenía cantidades predeterminadas de primeros y segundos isótopos estables de un primer átomo en un nutriente, y dicha muestra experimental se cultivó en un segundo medio nutriente idéntico a dicho primer medio nutriente excepto en que contiene diferentes cantidades predeterminadas de dichos primeros y segundos isótopos estables de dicho primer átomo en dicho nutriente en comparación con dicho primer medio nutriente, siendo dichos primeros y segundos isótopos estables diferentes a hidrógeno (1H) o deuterio (D), cultivándose dicha muestra experimental con un régimen estresante que contiene un agente estresante durante un periodo de tiempo suficiente para que dicha muestra crezca y dicha muestra de control se cultiva durante el mismo periodo de tiempo con un régimen idéntico al régimen estresante excepto que carece de agente estresante;

b) analizar mediante espectroscopia de masas dicha muestra de organismo biológico compuesto para picos de analito;

c) determinar la proporción del primer isótopo estable con el segundo isótopo estable para cada pico de analito analizado;

d) determinar la proporción isotópica estable media de la muestra de organismo biológico compuesto; y

e) comparar la proporción del primer isótopo estable con el segundo isótopo estable para cada pico de analito analizado con la proporción isotópica estable media de la muestra biológica compuesta, un analito cuya proporción isotópica estadísticamente y de manera significativa se desvía de la proporción isotópica estable media de la muestra biológica compuesta estando un analito afectado por el agente estresante.

Método para generación y uso de patrones isotópicos en datos espectrales de masa de organismos simples

Campo técnico La presente solicitud se refiere a la creación y uso de patrones isotópicos en análisis espectrales de masa. Estos patrones pueden introducirse por medio de métodos biológicos o no biológicos, o combinaciones de ambos. Más específicamente, los patrones isotópicos pueden usase en sistemas biológicos para determinar la respuesta bioquímica de un organismo vivo a un estresante físico, fisiológico, químico o externamente inducido.

La patente de Estados Unidos 6.849.396 desvela un método para conducir un análisis metabólico que comprende determinar valores de flujo metabólico para una pluralidad de analitos dianas controlando la relativa abundancia de isótopos de un isótopo estable en un sustrato etiquetado con el isótopo estable y/o uno o más metabolitos dianas formados por medio de metabolismo del sustrato etiquetado.

La patente de Estados Unidos 7.045.296 desvela un proceso para analizar muestras de proteínas usando electroforesis de gel y espectrometría de masas.

La publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2007/0123791 A1 desvela un método para distinguir si un animal está experimentando una infección bacteriana o una infección viral que comprende el control de la respiración tomada del animal y la medición de la cantidad relativa de un primer isótopo estable de respiración con un segundo isótopo estable de respiración en el mismo conforme avanza el tiempo.

La patente de Estados Unidos 5.912.178 desvela un método para determinar la presencia de un estado catabólico en un organismo o una colección de organismos que comprende la medición de cambios en proporciones isotópicas en materiales biológicos obtenidos de los mismos.

Técnica anterior

El uso de isótopos estables para la determinación de información biológica tiene una larga e ilustre historia [véase, Hellerstein, Metabolic Engineering 6:85-100 (2004) ]. El uso más antiguo y frecuente está en los estudios que exploran el metabolismo donde se incorpora un isótopo estable en una molécula específica en una localización específica. Esta molécula isotópicamente etiquetada, o “precursora”, se introduce en un organismo in vivo, sistema celular in vitro o sistema libre de células in vitro durante un periodo de tiempo corto o largo, después del cual se determina el destino del isótopo, bien mediante el uso de NMR, espectrometría de masas (EM) , degradación química u otra técnica de detección.

A diferencia del uso de isótopos radioactivos, el uso de isótopos estables se considera generalmente seguro y libre de regulación. Aunque en general un estudio usa típicamente un único isótopo incorporado a una localización específica con el fin de conseguir una precisión en la compresión del destino metabólico de una molécula, otra realización del uso de isótopos estables utiliza moléculas completamente etiquetadas (>99% de un átomo se sustituye por un equivalente isotópico) , o universalmente etiquetadas (el isótopo se distribuye universalmente en la molécula diana en niveles inferiores al de saturación) . Hay muchos estudios conocidos en los que se incorpora más de un isótopo en una molécula diana, y todos los fragmentos isotópicos se examinan para sus destinos diferenciales. En todos los casos, estos métodos son análisis dirigidos, esto es, buscan la incorporación de un átomo específico etiquetado en otra molécula específica.

Otro uso más de compuestos estables isotópicamente etiquetados es un estándar interno para sus equivalentes no etiquetados. En tal experimento una molécula isotópicamente enriquecida se añade a una muestra o extracto en una concentración requerida antes de un análisis, y la medición final determina la concentración exacta del material no etiquetado mediante comparación. En este tipo de estudio, no es infrecuente para un investigador añadir más de un estándar isotópicamente distinto si se va a cuantificar más de una molécula. De hecho, hay formas extremas donde se prepara una mezcla extremadamente compleja cultivando un organismo complejo sobre una materia prima isotópicamente definida de tal manera que el organismo completo esté fuertemente, si no completamente, compuesto por moléculas que consisten solamente en un isótopo [Wu et al., Anal. Biochem 336:164-171 (2005) ]. En esta situación, se introduce el mismo estándar en todas las muestras, pero el estándar no transporta ninguna información diferente a la de los fines de la cuantificación relativa, esto es, el estándar no tiene relación con el experimento que se está tratando. Históricamente, tales estándares se construyen cuidadosamente para diferenciarse de otro cualquier analito mediante una diferencia de masa específica.

Breve resumen de la invención En un aspecto, la presente invención contempla un método para identificar un analito de una muestra biológica al que un estresante afecta. El método comprende las etapas de proporcionar una muestra de organismo biológico compuesto que está compuesto por dos muestras mezcladas de organismos biológicos que son una muestra de control y una muestra experimental. La muestra de control se había cultivado en un primer medio nutriente que contenía cantidades predeterminadas de primeros y segundos isótopos de un primer átomo en un nutriente, mientras que la muestra experimental se cultivó en un segundo medio nutriente idéntico al primer medio nutriente excepto en que contiene diferentes cantidades predeterminadas de los primeros y segundos isótopos de ese primer átomo en el nutriente en comparación con dicho primer medio nutriente. Los primeros y segundos isótopos son diferentes a hidrógeno (1H) o deuterio (D) .

La muestra experimental se cultiva con un régimen estresante que contiene un agente estresante durante un periodo de tiempo suficiente para que la muestra crezca y la muestra de control se cultiva durante el mismo periodo de tiempo con un régimen idéntico excepto que carece de agente estresante. El agente estresante puede ser un medio químico, genético o cualquier elemento o combinación de elementos que indicen alteración fisiológica. La muestra de organismo biológico compuesto se analiza mediante espectroscopia de masas para picos de analito. Se determina la proporción de primer isótopo estable con segundo isótopo estable para cada pico de analito analizado. Se determina la proporción isotópica estable media de la muestra de organismo biológico compuesto. La proporción del primer isótopo estable con el segundo isótopo estable para cada pico de analito analizado se compara con la proporción isotópica estable media de la muestra biológica compuesta, y un analito cuya proporción isotópica estable estadísticamente y de manera significativa se desvía de la proporción isotópica estable media de la muestra biológica compuesta es un analito afectado por el agente estresante.

Otro aspecto de esta invención contempla otro método para identificar un analito de una muestra biológica al que un estresante afecta. El método comprende las etapas de proporcionar dos muestras biológicas, una primera muestra que es una muestra de control y la segunda muestra que es una muestra experimental. La muestra de control se condiciona con una primera composición que contiene cantidades predeterminadas de primeros y segundos isótopos estables de un primer átomo en un nutriente, y la muestra experimental está condicionadas en una segunda composición que es idéntica excepto en que contiene diferentes cantidades predeterminadas de esos primeros y segundos isótopos de ese primer átomo en el nutriente. Los primeros y segundos isótopos son diferentes a 1H o D. La palabra “condicionado” aquí se usa para significar cultivado durante unos pocos ciclos en ausencia de compuesto estresante.

La muestra experimental se cultiva en el segundo medio nutriente con un régimen estresante que contiene un agente estresante. Ese régimen estresante se mantiene durante un periodo de tiempo suficiente para que la muestra experimental crezca. La muestra de control se cultiva en el primer medio nutriente con un régimen idéntico al régimen estresante usado para la muestra experimental excepto en que carece de agente estresante. El régimen se mantiene durante un periodo de tiempo suficiente para que la muestra de control crezca.

Las dos muestras se mezclan, preferentemente en cantidades idénticas, para formar una muestra biológica compuesta. La muestra biológica compuesta así formada se analiza espectroscópicamante para picos de analito. La proporción del primer isótopo con el segundo isótopo se determina para los picos de analito analizados.... [Seguir leyendo]

1. Un método para identificar un analito de una muestra biológica al que un estresante afecta que comprende las etapas de: a) proporcionar una muestra de organismo biológico compuesto que está compuesto por dos muestras mezcladas de organismos biológicos que son una muestra de control y una muestra experimental, donde dichos organismos de muestra de control se han cultivado en un primer medio nutriente que contenía cantidades predeterminadas de primeros y segundos isótopos estables de un primer átomo en un nutriente, y dicha muestra experimental se cultivó en un segundo medio nutriente idéntico a dicho primer medio nutriente excepto en que contiene diferentes cantidades predeterminadas de dichos primeros y segundos isótopos estables de dicho primer átomo en dicho nutriente en comparación con dicho primer medio nutriente, siendo dichos primeros y segundos isótopos estables diferentes a hidrógeno (1H) o deuterio (D) , cultivándose dicha muestra experimental con un régimen estresante que contiene un agente estresante durante un periodo de tiempo suficiente para que dicha muestra crezca y dicha muestra de control se cultiva durante el mismo periodo de tiempo con un régimen idéntico al régimen estresante excepto que carece de agente estresante; b) analizar mediante espectroscopia de masas dicha muestra de organismo biológico compuesto para picos de analito; c) determinar la proporción del primer isótopo estable con el segundo isótopo estable para cada pico de analito analizado; d) determinar la proporción isotópica estable media de la muestra de organismo biológico compuesto; y e) comparar la proporción del primer isótopo estable con el segundo isótopo estable para cada pico de analito analizado con la proporción isotópica estable media de la muestra biológica compuesta, un analito cuya proporción isotópica estadísticamente y de manera significativa se desvía de la proporción isotópica estable media de la muestra biológica compuesta estando un analito afectado por el agente estresante.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho primer y segundo medio nutriente contienen además cantidades predeterminadas de primeros y segundos isótopos de un segundo átomo en un nutriente.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde dicha muestra de organismo biológico es un cultivo celular.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3 donde dicho cultivo celular está compuesto por células de planta.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, donde dichas células de planta son células de algas.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 4, donde dichas células de planta son células superiores de planta.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 3, donde dicho cultivo celular está compuesto por células de levadura.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 3, donde dicho cultivo celular está compuesto por células de animales.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho nutriente se selecciona del grupo consistente en un sacárido, un aminoácido y una sal.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dichos primeros y segundos isótopos estables se seleccionan del grupo consistente en 12C y 13C; 16O, 17O y 18º; 14N y 15N; 32S, 33S, 34S y 36S; 35Cl y 37Cl; 24Mg, 25Mg y 26Mg; 27Si, 28Si y 29Si; 40Ca, 42CA, 43Ca y 44Ca; y 79Br y 81Br.

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dichas muestras mezcladas en la etapa (a) se mezclan en cantidades iguales.

12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la proporción del primer isótopo con el segundo isótopo se analiza para menos que todos los picos de analito.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde los picos de analito para los que dicha muestra biológica compuesta se analiza se seleccionan del grupo consistente en metabolitos, sacáridos, polipéptidos, glicopéptidos, polinucleótidos y mezclas de los mismos.