Método de separación de colágeno de tejido animal, método de fabricación de una solución de colágeno y producto manufacturado usando dicho método.

Un método para separar colágeno de un tejido animal,

obteniendo de este modo colágeno a del 5 al 10% del peso del tejido inicial, que comprende.

Método de separación de colágeno de tejido animal, método de fabricación de una solución de colágeno y producto manufacturado usando dicho método.

Campo técnico La presente invención se refiere a un método para la separación de colágeno de diversos tejidos animales, un método para preparar una solución de colágeno y un producto manufacturado usando dicho método. Más específicamente, la presente invención se refiere a un método para la separación eficaz de colágeno de tejidos óseo y cartilaginoso, tejidos cutáneos y tejidos tendinosos/ligamentosos animales, un método para preparar una solución de colágeno a partir de dichos tejidos aislados y una matriz de colágeno y solución de colágeno altamente concentrada usando dicho método.

Técnica antecedente

Tal como se conoce en general, el colágeno es una proteína de la clase de escleroproteínas que constituye huesos, cartílago, dientes, tendones y piel de animales y también escamas de los peces. El colágeno está presente como un sólido similar a una fibra y muestra la intrincada estructura periódica estriada transversalmente al examinarlo con un microscopio electrónico.

El colágeno es una proteína estructural que se encuentra de la forma más frecuente en todo tipo de mamíferos, y comprende aproximadamente el 30% del peso total de todas las proteínas en el cuerpo. Actualmente, se conocen 20 especies de colágeno y el colágeno de tipo I es la forma de colágeno más abundante. El colágeno tiene una estructura en la que proteínas monoméricas que tienen un peso molecular de aproximadamente 300 kDa se reticulan entre sí mediante enlaces covalentes en sitios específicos. Por lo tanto, el colágeno maduro forma una forma similar a una fibra característica que tiene insolubilidad en agua y resistencia a la tracción elevada. El colágeno se compone de aminoácidos constituyentes tales como glicina, prolina, hidroxiprolina, alanina y ácido glutámico, y se caracteriza particularmente por un alto contenido de hidroxiprolina que no se encuentra habitualmente en otras formas de proteínas.

Mientras tanto, dicho colágeno tiene una estructura en la que tres cadenas polipeptídicas están enrolladas en espiral unas alrededor de otras, mediante puentes de hidrógeno. El colágeno no se descompone en agua, ácidos diluidos y álcalis diluidos, pero la ebullición del colágeno da como resultado la conversión del mismo en una estructura de una sola cadena de gelatina que es soluble. A diferencia de la gelatina, el colágeno puede adquirir una viscosidad adecuada sin calentarlo y, por lo tanto, puede prepararse convenientemente cuando es sometido a gelificación. Además, debido a su peso molecular más elevado que la gelatina, el colágeno es más biocompatible con tejidos biológicos y muestra una elevada actividad fisiológica. Por lo tanto, cuando se usa para tratar heridas, el colágeno facilita un proceso de cicatrización, que contrasta con la tendencia en la que la gelatina interfiere en la generación tisular. Además, el colágeno es altamente flexible incluso cuando está endurecido, y reticula rápidamente en un corto periodo de tiempo, dando como resultado de este modo un tiempo de gelificación reducido. El colágeno no es susceptible a la acción de enzimas proteolíticas tales como tripsina, pepsina, ficina, papaína y elastinasa, mientras que es susceptible a la descomposición por colagenasa. La separación de colágeno de tejidos implica extracción con disolvente orgánico, tratamiento con ácido/álcali, seguido por acción de enzimas proteolíticas tales como tripsina, pepsina, ficina, papaína y elastinasa, obteniendo de este modo colágeno.

Además, para aplicaciones in vivo, el colágeno obtenido de este modo se disuelve en disolventes no tóxicos biológicamente, por ejemplo tampones tales como agua, solución salina fisiológica y tampón borato, o soluciones acuosas que contienen sales, por ejemplo cloruro sódico, proteínas, sacáridos y grasas.

Actualmente se están realizando muchos estudios para el desarrollo de un método eficaz para separar colágeno. Para garantizar cantidades suficientes de colágeno para uso médico, grandes cantidades de materias primas son necesarias y también se requiere un avance significativo en un método de separación de colágeno.

En particular, se sabe que el colágeno no solamente desempeña un papel en un incremento de una concentración de plaquetas y la agregación de plaquetas pero también sirve para activar las plaquetas mediante la deformación de formas o estructuras bioquímicas de plaquetas, y por lo tanto el colágeno se usa ampliamente como hemostático.

Se han conocido numerosos métodos para separar colágeno desde la década de 1950, pero existe una dificultad en la separación de colágeno puro en una forma no desnaturalizada. Por lo tanto, sigue existiendo un requisito para el desarrollo de un método que es capaz de separar colágeno de diversos tejidos y en grandes cantidades, para usar colágeno en diversos campos.

Sin embargo, los métodos de separación de colágeno conocidos actualmente se basan principalmente en la separación de colágeno de la piel o de tendones de mamíferos (murino, bovino, porcino y similares) . Desafortunadamente, aún no existe ningún método capaz de separar el colágeno de los tejidos óseos.

Divulgación de la invención

Problema técnico Por lo tanto, la presente invención se ha realizado en vista de los problemas anteriores, y es un primer objeto de la presente invención proporcionar un método para la separación y la utilización de colágeno de diversos tejidos de animales.

Para este propósito, un segundo objeto de la presente invención es proporcionar un método para la separación eficaz de colágeno de tejidos óseos y cartilaginosos, tejidos cutáneos y tejidos de tendinosos/ligamentosos de animales.

Un tercer objeto de la presente invención es proporcionar un método para preparar una solución de colágeno a partir de dichos tejidos separados.

Un cuarto objeto de la presente invención es proporcionar una matriz de colágeno y una solución de colágeno altamente concentrada usando la solución de colágeno anterior.

Un quinto objeto de la presente invención es proporcionar un método para separar colágeno de diversos tejidos de animales, un método para preparar una solución de colágeno y un producto manufacturado usando dicho método, que son adecuados para mejorar la satisfacción del cliente mediante una calidad y fiabilidad del producto notablemente mejoradas.

Solución técnica De acuerdo con un aspecto de la presente invención, los anteriores y otros objetos pueden conseguirse mediante la provisión de un método para preparar una solución de colágeno a partir de diversos tejidos de un animal, que comprende, en el momento del tratamiento final de colágeno, tratar una solución de colágeno que tiene una concentración predeterminada en condiciones neutras a una baja temperatura, seguido por tratamiento durante una noche a una temperatura de 30 a 35ºC; concentrar colágeno mediante centrifugado; y disolver el colágeno concentrado de este modo en disolvente débilmente ácido refrigerado o solución salina tamponada con fosfato (PBS) , preparando de este modo una solución que tiene una concentración de colágeno de 1 a 5 mg/ml.

Breve descripción de los dibujos Los anteriores y otros objetos, características y otras ventajas de la presente invención se entenderán más claramente a partir de la siguiente descripción detallada tomada junto con los dibujos adjuntos, en los que:

La figura 1 es una fotografía que muestra patrones y resultados de SDS-PAGE de colágeno aplicado a la presente invención, en base a la separación por tamaños de proteína;

La figura 2 es un gráfico y una fotografía que muestran resultados del análisis de colágeno aplicado a la presente invención, usando un analizador de imágenes;

La figura 3 es una fotografía de un producto de matriz fabricado usando colágeno de acuerdo con la presente invención; y

La figura 4 es una fotografía de un producto de solución de colágeno altamente concentrada fabricado usando colágeno de acuerdo con la presente invención.

Mejor modo de llevar a cabo la invención Las realizaciones preferidas de la presente invención para conseguir los objetos mencionados anteriormente se describirán ahora en más detalle en referencia a los dibujos adjuntos.

Un método para separar colágeno de diversos tejidos de animales, un método para preparar una solución de colágeno y un producto manufacturado usando dicho método, que se aplican a la presente invención, se constituyen tal como se muestra en las figuras 1 a 4.

1. Un método para separar colágeno de un tejido animal, obteniendo de este modo colágeno a del 5 al 10% del peso del tejido inicial, que comprende

1. lavar exhaustivamente un tejido óseo aislado porcino con agua destilada, etanol y acetona;

2. cortar el tejido óseo en forma de rosquilla y almacenarlo a -20ºC;

3. procesar el tejido óseo a un polvo que tiene un tamaño de partícula de 1 a 500 micrómetros, para separar el colágeno del tejido óseo;

4. lavar el polvo de tejido óseo con etanol y agua destilada;

5. tratar el polvo óseo lavado de este modo durante una noche con HCl 0, 5 N mientras se agitaba a de 10 a 100 rpm;

6. tratar el polvo óseo con pepsina (relación de 10 a 50:1 del tejido:pepsina, y disuelta en HCl 0, 1 N antes del uso) , después del tratamiento durante una noche;

7. repetir el tratamiento con pepsina de 2 a 5 veces durante de 3 a 7 días;

8. centrifugar la solución de polvo óseo tratado con pepsina a 4ºC y 12.000 g durante 30 minutos, y a continuación separar y almacenar un sobrenadante y devolver un precipitado a la etapa 7;

9. aplicar una concentración final de NaCl de 0, 5 a 0, 8 M al sobrenadante separado y almacenado, seguido por tratamiento a 4ºC durante de 4 horas a 1 día;

10. retirar un precipitado y recoger un sobrenadante, después del centrifugado (12.000 g, 30 minutos y 4ºC) ;

11. valorar el sobrenadante en condiciones neutras y añadir NaCl para preparar una concentración final de la solución a NaCl 1, 6 M;

12. tratar la solución resultante a 4ºC durante de 4 horas a 1 día, seguido por centrifugado, y retirar de nuevo un precipitado y recoger un sobrenadante;

13. adicionalmente añadir NaCl al sobrenadante recogido a una concentración final de NaCl 2, 6 M, seguido por un periodo de reposo a 4ºC durante de 4 horas a 1 día;

14. centrifugar para retirar un sobrenadante, y lavar el precipitado resultante una o dos veces con etanol al 9, 5%, seguido por resuspensión en agua destilada;

15. añadir HCl 1 N a la solución resuspendida en una cantidad de relación de 1 ml:100 ml para conseguir la resuspensión completa, seguido por valoración a 4ºC en condiciones neutras;

16. dejar reposar a la solución valorada de este modo a una temperatura de 30 a 37ºC durante de 4 horas a 1 día, seguido por centrifugado; y

17. resuspender el colágeno precipitado de este modo a una concentración de 1 a 30 mg/ml en disolvente débilmente ácido o PBS, seguido por almacenamiento a 4ºC.

2. Un método para separar colágeno de un tejido animal, obteniendo de este modo colágeno a del 5 al 10% del peso del tejido inicial, que comprende

1. lavar exhaustivamente un tejido cartilaginoso aislado porcino con agua destilada, etanol y acetona;

2. procesar el tejido cartilaginoso a un polvo que tiene un tamaño de partícula de 1 a 500 micrómetros, para separar el colágeno del tejido cartilaginoso;

3. lavar el polvo de tejido cartilaginoso con etanol y agua destilada;

4. tratar el tejido cartilaginoso lavado de este modo durante una noche con una solución de guanidina-HCl (guanidina-HCl 4 M, Tris-HCl 0, 05 M, pH 7, 5) ;

5. lavar el polvo de cartílago tratado durante una noche una o dos veces con HCl 0, 1 N;

6. tratar el polvo de cartílago lavado de este modo durante una noche con HCl 0, 5 N mientras se agitaba a de 10 a 100 rpm;

7. tratar el polvo de cartílago con pepsina (relación de 10 a 50:1 del tejido:pepsina, y disuelta en HCl 0, 1 N antes del uso) , después del tratamiento durante una noche;

8. repetir el tratamiento con pepsina de 2 a 5 veces durante de 3 a 7 días;

9. centrifugar la solución de polvo de cartílago tratado con pepsina a 4ºC y 12.000 g durante 30 minutos, y a continuación separar y almacenar un sobrenadante y devolver un precipitado a la etapa 8;

10. aplicar una concentración final de NaCl de 0, 5 a 0, 8 M al sobrenadante separado y almacenado, seguido por tratamiento a 4ºC durante de 4 horas a 1 día;

11. retirar un precipitado y recoger un sobrenadante, después del centrifugado (12.000 g, 30 minutos y 4ºC) ;

12. valorar el sobrenadante en condiciones neutras y añadir NaCl para preparar una concentración final de la solución a NaCl 2, 6 M;

13. tratar la solución resultante a 4ºC durante de 4 horas a 1 día, seguido por centrifugado, y retirar de nuevo un precipitado y recoger un sobrenadante;

14. adicionalmente añadir NaCl al sobrenadante recogido a una concentración final de NaCl de 3, 5 a 4, 0 M, seguido por un periodo de reposo a 4ºC durante de 4 horas a 1 día;

15. centrifugar para retirar un sobrenadante, y lavar el precipitado resultante una o dos veces con etanol al 95%, seguido por resuspensión en agua destilada;

16. añadir HCl 1 N a la solución resuspendida en una cantidad de relación de 1 ml:100 ml para conseguir la resuspensión completa, seguido por valoración a 4ºC en condiciones neutras;

17. dejar reposar a la solución valorada de este modo a una temperatura de 30 a 37ºC durante de 4 horas a 1 día, seguido por centrifugado; y

18. resuspender el colágeno precipitado de este modo a una concentración de 1 a 30 mg/ml en disolvente débilmente ácido o PBS, seguido por almacenamiento a 4ºC.

3. Un método para separar colágeno de un tejido animal, obteniendo de este modo colágeno a del 10 al 15% del peso del tejido inicial, que comprende

1. lavar exhaustivamente un tejido cutáneo aislado porcino con agua destilada y etanol, seguido por almacenamiento a -20ºC;

2. procesar el tejido cutáneo en una sección que tiene un grosor de 500 micrómetros a 5 mm, para separar el colágeno del tejido cutáneo;

3. colocar la sección tisular en una red que tiene un tamaño de malla de 200 a 500 micrómetros y lavar con etanol y agua destilada;

4. tratar el tejido cutáneo lavado de este modo con pepsina (relación de 10 a 50:1 del tejido:pepsina, y disuelta en HCl 0, 1 N antes del uso) ;

5. repetir el tratamiento con pepsina de 2 a 3 veces durante de 2 a 3 días;

6. centrifugar la solución de tejido cutáneo tratado con pepsina a 4ºC y 12.000 g durante 30 minutos, y a continuación separar y almacenar un sobrenadante y devolver un precipitado a la etapa 5;

7. aplicar una concentración final de NaCl de 0, 5 a 0, 8 M al sobrenadante separado y almacenado, seguido por tratamiento a 4ºC durante de 4 horas a 1 día;

8. retirar un precipitado y recoger un sobrenadante, después del centrifugado (12.000 g, 30 minutos y 4ºC) ;

9. valorar el sobrenadante en condiciones neutras y añadir NaCl para preparar una concentración final de la solución a NaCl 1, 6 M;

10. tratar la solución resultante a 4ºC durante de 4 horas a 1 día, seguido por centrifugado y retirar de nuevo un precipitado y recoger un sobrenadante;

11. adicionalmente añadir NaCl al sobrenadante recogido a una concentración final de NaCl 2, 6 M, seguido por un periodo de reposo a 4ºC durante de 4 horas a 1 día;

12. centrifugar para retirar un sobrenadante, y lavar el precipitado resultante una o dos veces con etanol al 95%, seguido por resuspensión en agua destilada;

13. añadir HCl 1 N a la solución resuspendida en una cantidad de relación de 1 ml:100 ml para conseguir la resuspensión completa, seguido por valoración a 4ºC en condiciones neutras;

14. dejar reposar a la solución valorada de este modo a una temperatura de 30 a 37ºC durante de 4 horas a 1 día, seguido por centrifugado; y

15. resuspender el colágeno precipitado de este modo a una concentración de 1 a 30 mg/ml en disolvente débilmente ácido o PBS, seguido por almacenamiento a 4ºC.

4. Un método para separar colágeno de un tejido animal, obteniendo de este modo colágeno a del 10 al 20% del peso del tejido inicial, que comprende

1. lavar exhaustivamente un tejido tendinoso/ligamentoso aislado porcino con agua destilada y etanol, seguido por almacenamiento a -20ºC;

2. procesar el tejido tendinoso/ligamentoso en una sección que tiene un grosor de 500 micrómetros a 5 mm, para separar el colágeno del tejido tendinoso/ligamentoso;

3. lavar la sección tisular con etanol y agua destilada;

4. tratar el tejido tendinoso/ligamentoso lavado de este modo con pepsina (relación de 10 a 50:1 del tejido:pepsina, y disuelta en HCl 0, 1 N antes del uso) ;

5. repetir el tratamiento con pepsina de 2 a 3 veces durante de 2 a 3 días;

6. centrifugar la solución de tejido tendinoso/ligamentoso tratado con pepsina a 4ºC y 12.000 g durante 30 minutos, y a continuación separar y almacenar un sobrenadante y devolver un precipitado a la etapa 5;

7. aplicar una concentración final de NaCl de 0, 5 a 0, 8 M al sobrenadante separado y almacenado, seguido por tratamiento a 4ºC durante de 4 horas a 1 día;

8. retirar un precipitado y recoger un sobrenadante, después del centrifugado (12.000 g, 30 minutos y 4ºC) ;

9. valorar el sobrenadante en condiciones neutras y añadir NaCl para preparar una concentración final de la solución a NaCl 1, 6 M;

10. tratar la solución resultante a 4ºC durante de 4 horas a 1 día, seguido por centrifugado, y retirar de nuevo un precipitado y recoger un sobrenadante;

11. adicionalmente añadir NaCl al sobrenadante recogido a una concentración final de NaCl 2, 6 M, seguido por un periodo de reposo a 4ºC durante de 4 horas a 1 día;

12. centrifugar para retirar un sobrenadante, y lavar el precipitado resultante una o dos veces con etanol al 95%, seguido por resuspensión en agua destilada;

13. añadir HCl 1 N a la solución resuspendida en una cantidad de relación 1 ml:100 ml para conseguir la resuspensión completa, seguido por valoración a 4ºC en condiciones neutras;

14. dejar reposar a la solución valorada de este modo a una temperatura de 30 a 37ºC durante de 4 horas a 1 día, seguido por centrifugado; y

15. resuspender el colágeno precipitado de este modo a una concentración de 1 a 30 mg/ml en disolvente débilmente ácido o PBS, seguido por almacenamiento a 4ºC.

5. Un método para preparar una solución de colágeno a partir de un tejido animal, que comprende, durante el tratamiento final del colágeno: tratar una solución de colágeno tal como preparada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4

que tiene una concentración predeterminada en condiciones neutras a 4ºC, seguido por tratamiento durante una noche a una temperatura de 30 a 35ºC; concentrar el colágeno mediante centrifugado; y

disolver el colágeno concentrado de este modo en disolvente débilmente ácido refrigerado o

solución salina tamponada con fosfato (PBS) , preparando de este modo colágeno que tiene una concentración

de 1 a 5 mg/ml.

6. Un método para preparar una matriz de colágeno, que comprende:

5 inyectar aire puro filtrado en una solución de colágeno tal como preparada de acuerdo con cualquiera de las

reivindicaciones 1 a 5 a una concentración adecuada a de 3 a 5 mg/ml y pH para formar de este modo poros

predeterminados; y

liofilizar la solución con foros formados para preparar una matriz,

10 en el que la matriz se prepara a partir de una solución de colágeno que tiene una concentración de colágeno de 3 a 5 mg/ml, y se prepara inyectando aire puro filtrado en la solución de colágeno a un pH de 5, 0 a 6, 0,

para formar de este modo poros predeterminados,

liofilizar la solución de colágeno con poros formados,

envasar los liofilizados resultantes mediante tratamiento térmico y esterilizarlos con óxido de etileno (EO)

gaseoso o irradiación con rayos gamma (rayos y) para preparar de este modo una matriz de colágeno.

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