Marcador de células germinales que utiliza el gen Vasa de peces.

Proteína que está constituida por la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 2 en el listado desecuencias,

que se expresa específicamente en una célula germinal de atún de aleta azul.

Marcador de células germinales que utiliza el gen Vasa de peces.

La presente invención se refiere a una proteína Vasa de peces Perciformes tales como el atún, a un gen Vasa de peces Perciformes tales como el atún, a un método para detectar las células germinales de peces Perciformes tales como el atún utilizando dicha proteína Vasa o gen Vasa como diana, a un método para evaluar el crecimiento y/o la maduración de las células germinales de peces Perciformes donantes tales como el atún, que han sido trasplantadas en peces receptores de una especie diferente, utilizando el método de detección anteriormente indicado, y similares.

Antecedentes de la técnica D1 (Xu et al., Dev. Dynam. 233:872-882, 2005) da a conocer la expresión diferencial de ARN y proteína Vasa durante la espermatogénesis y la oogénesis en la carpa gibel (Carassius auratus gibelio) . Esta carpa es un vertebrado de reproducción bisexual y ginogenética.

D2 (Kobayashi et al., Mech. Dev. 99:139-142, 2000) da a conocer la expresión diferencial de un gen homólogo de Vasa en las células germinales durante la oogénesis y la espermatogénesis en el pez teleósteo Oreochromis niloticus.

D3 (Knaut et al., Current Biology 12:454-466, 2002) da a conocer una región evolutivamente conservada en la UTR 3' de Vasa dirige la traducción del ARN a las células germinales en peces cebra.

D4 (Cardinali et al., Biol. Reprod. 70:737-743, 2004) da a conocer la regulación hormonal de la expresión del ARN mensajero de tipo Vasa en el ovario del teleósteo marino Sparus aurata.

D5 (número de acceso de base de datos DQ174775) da a conocer la secuencia codificante completa del ARNm de la proteína de tipo Vasa (vas) de Monopterus albus.

Raz (Raz, Genome Biology 1 (3) , revisión 1017, 2000) expone la función y regulación de los genes de tipo Vasa en el desarrollo de las células germinales.

El documento WO 02/029064 describe un método para establecer la expresión específica de células germinales de secuencias de ácidos nucleicos en vertebrados.

Mediante análisis genético de Drosophila se ha puesto de manifiesto que los genes Oskar, Vasa, Tudor y Nanos presentan funciones esenciales en el mecanismo de determinación de las células germinales (por ejemplo Rongo C. et al., Development 121:2737-2746, 1995) . La totalidad de estos genes se acumula en el gránulo polar durante la formación de los óvulos, y al presentar este blastómero un factor de determinación materna, se determina el destino de la célula germinal. Se considera que el gen Vasa codifica la ARN helicasa dependiente de ATP y que sus funciones se asocian a la regulación de la traducción del ARNm en una proteína (por ejemplo Liang L. et al., Development 120:1201-1211, 1994) . Además, una estructura para su función enzimática se encuentra evolutivamente muy conservada. De esta manera, se han identificado genes homólogos de Vasa en muchas especies animales multicelulares, desde platelmintos (planarias) hasta seres humanos.

Basándose en los resultados anteriormente indicados, como método para separar fácilmente las células que presentan potencial de diferenciación de los óvulos que utiliza, a modo de indicador, la expresión de un gen marcador, sin realizar complicadas operaciones tales como la recombinación homóloga, se ha informado de un método para obtener una célula germinal, que comprende recuperar unas células que presentan potencial de diferenciación de células germinales a partir de un mamífero no humano transgénico, en el que se ha introducido un vector de expresión recombinante de manera que se encuentre bajo el control de la secuencia promotora de un gen homólogo de Vasa derivado del mamífero, utilizando la expresión del gen marcador a modo de indicador (por ejemplo las solicitudes de patente japonesa abiertas al público nº 2006-333762 y nº 2003-235558) .

Por otra parte, las células germinales primordiales son células de origen para óvulos y espermatozoides, las cuales son modificadas para un individuo mediante procedimientos de maduración y fertilización. Se conoce un método para inducir la diferenciación de unas células germinales primordiales separadas, derivadas de peces, en una línea de células germinales, que comprende trasplantar las células germinales primordiales separadas, derivadas de peces, en el embrión temprano de un pez receptor de una especie diferente, y particularmente trasplantar las células germinales primordiales separadas en la cavidad peritoneal de un pez receptor de una especie diferente en un estadio temprano del desarrollo (por ejemplo las patentes japonesas abiertas al público nº 2006-333762 y nº 2003235558) .

En la actualidad, para el cultivo del atún se ha puesto en práctica principalmente un método en el que el pescador captura peces juveniles autóctonos (en general entre varias decenas y varios cientos por gramo) y se crían. En los últimos años se han reducido las capturas de atún autóctono, por lo que se han limitado estrictamente las cuotas de captura de atunes maduros. Por lo tanto, no se garantiza un suministro estable de peces juveniles para el futuro mediante un método en el que se obtengan dichos peces juveniles de la naturaleza. Además, tal como en el caso del salmón y de Pagrus major, en el caso de que se estableciese una técnica de producción artificial en semilleros, se esperaría que pudiese llevarse a cabo la cría mediante alternancia de generaciones, seleccionando los peces progenitores que presentasen buenas características, y que los peces juveniles de calidad estable pudiesen suministrarse con una mejor eficiencia de cultivo. El mecanismo de maduración del atún todavía no ha sido clarificado suficientemente. Sin embargo, se considera que el atún alcanza la maduración inicial tras alcanzar su peso corporal varias decenas de kilogramos. Debido a que el tamaño corporal del atún es grande, a diferencia de otras especies de peces, se cría mediante producción en semillero mediante un método de recolección de huevos fertilizados depositados naturalmente por los peces parentales en un recinto o en una bahía cerrada utilizando una red finamente tejida. Debido a que Pagrus major y similares ovipositan en un tanque de agua, puede producirse fácilmente un dispositivo para recoger los huevos con una red mediante desbordamiento del agua marina de la superficie del tanque. Por el contrario, dicha operación realizada en mar abierto resulta dificultosa.

En el caso de que se requiera el apareamiento de peces individuales específicos con fines de cría o similares, se lleva a cabo la recolección artificial de huevos mediante compresión del abdomen de los peces hembra, así como la recolección del esperma de la misma manera, y los huevos y espermatozoides seguidamente se someten a inseminación artificial. Sin embargo, en el caso de que los peces progenitores sean de gran tamaño, como el atún, este método no resulta sencillo. Además, en el campo industrial, para la finalidad de controlar el tiempo de transporte y el periodo de cultivo de los peces, resulta posible incrementar la rentabilidad modificando el tiempo durante el que se producen los peces juveniles. Por lo tanto, resulta necesario controlar la temperatura del agua y el fotoperiodo en un sitio en el que los peces progenitores se encuentren en un ambiente controlado, de manera que se modifique la estación, controlando de esta manera el momento en el que los peces progenitores ovipositan. Sin embargo, en el caso de que los peces progenitores sean de gran tamaño, como el atún, resultan necesarios inversiones de personal y costes enormes.

La técnica de peces sustitutos es una técnica que permite que las especies de peces que resultan adecuadas para la producción de larvas produzcan los gametos de especies de peces que resultan inadecuadas para la producción de larvas o para depositar huevos y después someterlos a inseminación, de manera que resulte posible la producción sencilla de larvas a bajo coste. Por ejemplo, en el caso de que la técnica de peces sustitutos descrita en la patente japonesa abierta al público nº 2003-235558 anteriormente indicada al atún, de manera que resulte posible utilizar especies de peces de pequeño tamaño como peces receptores para la maduración de células germinales derivadas de atunes, puede llevarse a cabo el cultivo, incluyendo la producción de larvas, en un tanque de agua de pequeño tamaño, y se espera que resulte en ahorros significativos de personal y costes. Durante el trasplante de las células germinales primordiales separadas, resulta necesario propagar las células germinales primordiales derivadas de los atunes que se han incorporado en las gónadas de un receptor, y detectar la proporción entre las células germinales derivadas... [Seguir leyendo]

1. Proteína que está constituida por la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 2 en el listado de secuencias, que se expresa específicamente en una célula germinal de atún de aleta azul. 5

2. ADN codificante de una proteína que está constituida por la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 2 en el listado de secuencias, que se expresa específicamente en una célula germinal de atún de aleta azul.

3. ADN que está constituido por la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID nº 1 en el listado de 10 secuencias.

4. Vector recombinante que comprende el ADN según la reivindicación 2 o 3.

5. Transformante no humano transformado con el vector recombinante según la reivindicación 4. 15

6. Sonda para detectar la presencia de un ADN o ARNm codificante de la proteína según la reivindicación 1, constituida por los (a) o (b) siguientes:

(a) un ADN que está constituido por la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 17 o una secuencia 20 complementaria de la misma,

(b) un ARN complementario al ADN de (a) , anterior.

7. Método para detectar una célula germinal primordial, un espermatogonio o un oogonio derivado del atún, que ha sido trasplantado en una corvina honnibe, comprendiendo dicho método la utilización de la sonda según la reivindicación 6.

8. Método para detectar una célula germinal primordial, un espermatogonio o un oogonio derivado de atún de aleta azul, que ha sido trasplantado en una corvina honnibe, caballa o bacoreta oriental, comprendiendo dicho método las 30 etapas (A) a (C) siguientes:

(A) amplificar un fragmento de ADN mediante PCR anidada utilizando un primer juego de cebadores constituido por las secuencias de nucleótidos representadas por las SEC ID nº 19 y nº 20, y un juego de cebadores anidados constituido por las secuencias de nucleótidos representadas por las SEC ID nº 21 y nº 22,

(B) tratar el fragmento de ADN con un enzima de restricción HpaI; y

(C) determinar que el fragmento de ADN digerido se deriva del atún de aleta azul, y que el fragmento de ADN

no digerido se deriva de una corvina honnibe, caballa o bacoreta oriental. 40