Incorporación específica para sitio de aminoácidos activos por rédox en proteínas.

Una composición que comprende una aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) en la que la O-RS tiene almenos el 90 % de identidad de secuencias de aminoácidos con la longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO:

1 y en la que dicha O-RS tiene una eficiencia que es al menos el 50 % de la eficiencia de traducción observada parala aminoacil-ARNt sintetasa que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en el sistema detraducción que comprende 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina, el ARNt de SEQ ID NO: 2 y la aminoacil-ARNt sintetasa deSEQ ID NO: 1,

y en la que dicha O-RS aminoacila el O-ARNt con 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina preferencialmente

Incorporación específica para sitio de aminoácidos activos por rédox en proteínas.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención pertenece al campo de la bioquímica de traducción. La invención se refiere a composiciones y procedimientos para preparar y usar ARNt ortogonales, aminoacil-ARNt sintetasas ortogonales y pares de los mismos que incorporan aminoácidos activos por rédox en proteínas. La invención también se refiere a procedimientos de producción de proteínas en células usando tales pares y composiciones relacionadas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Entre los veinte aminoácidos comunes genéticamente codificados, sólo la cisteína experimenta una química rédox superficial y, como resultado, puede participar en una amplia variedad de reacciones de oxidación y reducción catalizadas por enzimas (Surdhar y Armstrong (1987) J. Phys. Chem., 91: 6532 – 6537; Licht y col. (1996) Science 271: 477 – 481) . Por consiguiente, la mayoría de los procesos rédox biológicos requieren cofactores tales como flavinas, nicotinamidas e iones metálicos. En casos raros, las quinonas derivadas de la modificación postraduccional de cadenas laterales de tirosina y triptófano se usan como el cofactor rédox (Stubbe y Van der Donk (1998) Chem. Rev., 98: 705 – 762) . Por ejemplo, la cobre amina oxidasa de plasma bovino usa 3, 4, 6-trihidroxi-Lfenilalanina (TOPA) en la conversión de aminas primarias y oxígeno molecular en aldehídos y peróxido de hidrógeno, respectivamente (Janes y col. (1990) Science 248: 981 – 987) . Estos catalizadores rédox derivados de aminoácidos se generan por tanto reacciones mediadas por radicales como enzimáticas (Rodgers y Dean (2000) Int.

J. Biochem. Cell Biol., 32: 945 – 955) . Claramente, la capacidad para codificar genéticamente aminoácidos activos por rédox adicionales, en vez de generarlos por mecanismos postraduccionales complejos, potenciaría significativamente la capacidad para tanto estudiar como manipular los procesos de transferencia de electrones en proteínas. La presente invención satisface estas y otras necesidades, como serán evidentes tras la revisión de la siguiente divulgación.

Wang, L. y col., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 100, pág. 56 – 61, describen la adición del grupo funcional ceto al código genético de Escherichia coli.

El documento WO 02/086075 A2 describe procedimientos y composiciones para la producción de pares de ARNt-aminoacil ARNt sintetasa ortogonales.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona, en un primer aspecto, una composición que comprende una aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) en la que la O-RS tiene al menos el 90 % de identidad de secuencias de aminoácidos con la longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO: 1 y en la que dicha O-RS tiene una eficiencia que es al menos el 50 % de la eficiencia de traducción observada para la aminoacil-ARNt sintetasa que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en el sistema de traducción que comprende 3, 4-dihidroxi-L-fenilalanina, el ARNt de SEQ ID NO: 2 y la aminoacil-ARNt sintetasa de SEQ ID NO: 1, y en la que dicha O-RS aminoacila el O-ARNt con 3, 4-dihidroxi-L-fenilalanina preferencialmente.

En algunas realizaciones, la O-RS comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una célula que comprende la composición del primer aspecto. En algunas realizaciones, la célula es una célula de E. coli.

En algunas realizaciones del primer aspecto de la invención la composición comprende un sistema de traducción.

En algunas realizaciones del segundo aspecto de la invención, la célula comprende:

un ARNt ortogonal (O-ARNt) que está codificado por una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencias de nucleótidos con la secuencia de longitud completa de SEQ ID NO: 2;

dicha O-RS; y,

un primer aminoácido no natural que es 3, 4-dihidroxi-L-fenilalanina (DHP) .

En algunas realizaciones del segundo aspecto de la invención, el O-ARNt está codificado por la secuencia de polinucleótidos que se expone en SEQ ID NO: 2.

En algunas realizaciones del segundo aspecto de la invención, la célula comprende además un segundo par de O-ARNt/O-RS y un segundo aminoácido no natural, en la que el segundo O-ARNt reconoce un segundo codón selector y la segunda O-RS aminoacila el segundo O-ARNt con el segundo aminoácido no natural preferencialmente.

En algunas realizaciones del segundo aspecto de la invención, la célula es una célula no eucariota. En algunas realizaciones, la célula no eucariota es una célula de E. coli.

En algunas realizaciones del segundo aspecto de la invención, la célula comprende además un ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés, en la que el polinucleótido comprende un codón selector que es reconocido por dicho O-ARNt.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido que comprende SEQ ID NO. 1.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido del tercer aspecto de la invención.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona un vector que comprende o que codifica un polinucleótido del cuarto aspecto de la invención. En algunas realizaciones, el vector comprende un plásmido, un cósmido, un fago o un virus.

En algunas realizaciones del quinto aspecto de la invención, el vector es un vector de expresión.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona una célula que comprende el vector del quinto aspecto de la invención.

En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para identificar una aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal que aminoacila específicamente un O-ARNt con 3, 4-dihidroxi-L-fenilalanina (DHP) , comprendiendo el procedimiento:

a) someter a selección una población de células de una primera especie, en la que las células comprenden cada una:

i) un miembro de una pluralidad de aminoacil-ARNt sintetasas (RS) ;

ii) el ARNt ortogonal (O-ARNt) ;

iii) un polinucleótido que codifica un marcador de selección y comprende al menos un codón selector que es reconocido por dicho O-ARNt; y,

iv) dicha DHP;

en la que células en dicha población que están potenciadas en la eficiencia de supresión comprenden un miembro de la pluralidad de RS que es una RS activa que aminoacila específicamente el O-ARNt con dicha DHP; y,

b) seleccionar la RS activa que aminoacila el O-ARNt con la DHP,

en el que dicha RS activa tiene una eficiencia que es al menos el 50 % de la eficiencia observada para la aminoacil-ARNt sintetasa que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en un sistema de traducción que comprende 3, 4-dihidroxi-L-fenilalanina, un ARNt de SEQ ID NO: 2 y la aminoacil-ARNt sintetasa de SEQ ID NO: 1; identificándose así la aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal que aminoacila específicamente el O-ARNt.

En algunas realizaciones del séptimo aspecto de la invención, la selección comprende una selección positiva y el marcador de selección comprende un marcador de selección positiva.

En algunas realizaciones del séptimo aspecto de la invención, la pluralidad de RS comprende RS mutantes, o RS derivadas de una o más especies distintas de la primera especie o tanto RS mutantes como RS derivadas de una especie distinta de la primera especie.

En un octavo aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de producción de una proteína en una célula con 3, 4-dihidroxi-L-fenilalanina (DHP) en una posición especificada, comprendiendo el procedimiento:

a) cultivar, en un medio apropiado, la célula del segundo aspecto de la invención,

b) proporcionar la DHP; y

c) incorporar la DHP en la posición especificada en la proteína durante la traducción del ácido nucleico con el al menos un codón selector, produciéndose así la proteína con dicha DHP en la posición especificada.

En algunas realizaciones del octavo aspecto de la invención, la O-RS comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 1.

En algunas realizaciones del octavo aspecto de la invención, la célula es una célula no eucariota. En algunas realizaciones, la célula no eucariota es una célula de E. coli.

DEFINICIONES

Ante de describir la invención en detalle debe entenderse que la presente invención no se limita a sistemas biológicos particulares que, por supuesto, pueden variar. También debe entenderse que... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende una aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) en la que la O-RS tiene al menos el 90 % de identidad de secuencias de aminoácidos con la longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO: 1 y en la que dicha O-RS tiene una eficiencia que es al menos el 50 % de la eficiencia de traducción observada para la aminoacil-ARNt sintetasa que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en el sistema de traducción que comprende 3, 4-dihidroxi-L-fenilalanina, el ARNt de SEQ ID NO: 2 y la aminoacil-ARNt sintetasa de SEQ ID NO: 1,

y en la que dicha O-RS aminoacila el O-ARNt con 3, 4-dihidroxi-L-fenilalanina preferencialmente.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que la O-RS comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

3. Una célula que comprende la composición de la reivindicación 1.

4. La célula de la reivindicación 3, en la que la célula es una célula de E. coli.

5. La composición de la reivindicación 1 que comprende un sistema de traducción.

6. La célula de la reivindicación 3, en la que dicha célula comprende:

un ARNt ortogonal (O-ARNt) que está codificado por una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencias de nucleótidos con la secuencia de longitud completa de SEQ ID NO: 2; dicha O-RS; y, un primer aminoácido no natural que es 3, 4-dihidroxi-L-fenilalanina (DHP) .

7. La célula de la reivindicación 6, en la que el O-ARNt está codificado por la secuencia de polinucleótidos que se expone en SEQ ID NO: 2.

8. La célula de la reivindicación 6, en la que la célula comprende además un segundo par de O-ARNt/O-RS y un segundo aminoácido no natural, en la que el segundo O-ARNt reconoce un segundo codón selector y la segunda O-RS aminoacila el segundo O-ARNt con el segundo aminoácido no natural preferencialmente.

9. La célula de la reivindicación 6, en la que la célula es una célula no eucariota.

10. La célula de la reivindicación 9, en la que la célula no eucariota es una célula de E. coli.

11. La célula de la reivindicación 6, en la que la célula comprende además un ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés, en la que el polinucleótido comprende un codón selector que es reconocido por dicho O-ARNt.

12. Un polipéptido que comprende SEQ ID NO. 1.

13. Un polinucleótido que codifica un polipéptido de la reivindicación 12.

14. Un vector que comprende o que codifica un polinucleótido de la reivindicación 13.

15. El vector de la reivindicación 14, en el que el vector comprende un plásmido, un cósmido, un fago o un virus.

16. El vector de la reivindicación 14, en el que el vector es un vector de expresión.

17. Una célula que comprende el vector de la reivindicación 14.

18. Un procedimiento para identificar una aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal que aminoacila específicamente un O-ARNt con 3, 4-dihidroxi-L-fenilalanina (DHP) , comprendiendo el procedimiento:

a) someter a selección una población de células de una primera especie, en la que las células comprenden cada una:

i) un miembro de una pluralidad de aminoacil-ARNt sintetasas (RS) ; ii) el ARNt ortogonal (O-ARNt) ;

iii) un polinucleótido que codifica un marcador de selección y comprende al menos un codón selector que es reconocido por dicho O-ARNt; y,

iv) dicha DHP;

en el que células en dicha población que están potenciadas en la eficiencia de supresión comprenden un miembro de la pluralidad de RS que es una RS activa que aminoacila específicamente el O-ARNt con dicha DHP; y,

b) seleccionar la RS activa que aminoacila el O-ARNt con la DHP, en el que dicha RS activa tiene una eficiencia que es al menos el 50 % de la eficiencia observada para la aminoacil-ARNt sintetasa que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en un sistema de traducción que comprende 3, 4-dihidroxi-L-fenilalanina, un ARNt de SEQ ID NO: 2 y la aminoacil-ARNt sintetasa de SEQ ID NO: 1;

identificándose así la aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal que aminoacila específicamente el O-ARNt.

19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que la selección comprende una selección positiva y el marcador de selección comprende un marcador de selección positiva.

20. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que la pluralidad de RS comprende RS mutantes, o RS derivadas de una o más especies distintas de la primera especie o tanto RS mutantes como RS derivadas de una especie distinta de la primera especie.

21. Un procedimiento de producción de una proteína en una célula con 3, 4-dihidroxi-L-fenilalanina (DHP) en una posición especificada, comprendiendo el procedimiento: a) cultivar, en un medio apropiado, la célula de la reivindicación 11,

b) proporcionar la DHP; e c) incorporar la DHP en la posición especificada en la proteína durante la traducción del ácido nucleico con el al menos un codón selector, produciéndose así la proteína con dicha DHP en la posición especificada.

22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que la O-RS comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 1.

23. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que la célula es una célula no eucariota.

24. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que la célula no eucariota es una célula de E. coli.