Híbridos de monómero-dímero quiméricos de inmunoglobulina.

Una proteína quimérica que comprende una primera cadena de polipéptidos y una segunda cadena depolipéptidos,

en donde dicha primera cadena de polipéptidos comprende un factor de coagulación y al menos una parte de unaregión constante de inmunoglobulina que es un componente de unión a receptor neonatal de Fc (FcRn), y

en donde dicha segunda cadena de polipéptidos consiste en una región constante de inmunoglobulina, o una partede la misma, que es un componente de unión a FcRn, para su uso en un procedimiento de tratamiento.

Híbridos de monómero-dímero quiméricos de inmunoglobulina Campo de la invención La presente descripción se refiere generalmente a proteínas quiméricas terapéuticas que comprenden dos cadenas de polipéptidos, en las que la primera cadena comprende una molécula biológicamente activa terapéutica y la segunda cadena no comprende la molécula biológicamente activa terapéutica de la primera cadena. Más específicamente, la presente descripción se refiere a proteínas quiméricas que comprenden dos cadenas de polipéptidos, en las que ambas cadenas comprenden al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina en la que la primera cadena se modifica para comprender además una molécula biológicamente activa, y la segunda cadena no se modifica así. Así, la presente descripción se refiere a una proteína quimérica que es un híbrido de monómero-dímero, es decir, una proteína quimérica que tiene un aspecto dimérico y un aspecto monomérico, refiriéndose el aspecto dimérico al hecho de que comprende dos cadenas de polipéptidos que comprende cada una una parte de una región constante de inmunoglobulina, y refiriéndose el aspecto monomérico al hecho de que solo una de las dos cadenas comprende una molécula biológicamente activa terapéutica. La Figura 1 ilustra un ejemplo de un híbrido de monómero-dímero en el que la molécula biológicamente activa es eritropoyetina (EPO) y la parte de una región constante de inmunoglobulina es una región Fc de IgG.

Antecedentes de la invención Las inmunoglobulinas comprenden cuatro cadenas de polipéptidos, dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, que se asocian mediante enlaces disulfuro para formar tetrámeros. Cada cadena comprende además una región variable y una región constante. Las regiones variables median en el reconocimiento de antígeno y la unión, mientras que las regiones constantes, particularmente las regiones constantes de la cadena pesada, median en una variedad de funciones efectoras, por ejemplo, unión a complemento y unión a receptor de Fc (véanse, por ejemplo, las patentes US: 6.086.875; 5.624.821; 5.116.964) .

La región constante comprende adicionalmente dominios denominados dominios CH (pesados constantes) (CH1, CH2, etc.) . Dependiendo del isotipo (es decir, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE) , la región constante puede estar comprendida de tres o cuatro dominios CH. Algunas regiones constantes de isotipos (por ejemplo, IgG) también contienen una región bisagra, Janeway y col. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.

Se ha descrito la creación de proteínas quiméricas que comprenden regiones constantes de inmunoglobulina ligadas a una proteína de interés, o fragmento de la misma (véanse, por ejemplo, las patentes US 5.480.981 y 5.808.029; Gascoigne y col. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2936; Capon y col. 1989, Nature 337:525; Traunecker y col. 1989, Nature 339:68; Zettmeissl y col. 1990, DNA Cell Biol. USA 9:347; Byrn y col. 1990, Nature 344:667; Watson y col. 1990, J. Cell. Biol. 110:2221; Watson y col. 1991, Nature 349:164; Aruffo y col. 1990, Cell 61:1303; Linsley y col. 1991, J. Exp. Med. 173:721; Linsley y col. 1991, J. Exp. Med. 174:561; Stamenkovic y col., 1991, Cell 66:1133; Ashkenazi y col. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535; Lesslauer y col. 1991, Eur. J. Immunol. 27:2883; Peppel y col. 1991, J. Exp. Med. 174:1483; Bennett y col. 1991, J. Biol. Chem. 266:23060; Kurschner y col. 1992, J. Biol. Chem. 267:9354; Chalupny y col. 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10360; Ridgway y Gorman, 1991, J. Cell. Biol. 115, Resumen nº 1448; Zheng y col. 1995, J. Immun. 154:5590) . Estas moléculas normalmente poseen tanto la actividad biológica asociada a la molécula ligada de interés, como además la función efectora, o alguna otra característica deseada asociada a la región constante de inmunoglobulina (por ejemplo, estabilidad biológica, secreción celular) .

La parte Fc de una región constante de inmunoglobulina, dependiendo del isotipo de la inmunoglobulina, puede incluir los dominios CH2, CH3 y CH4, además de la región bisagra. Proteínas quiméricas que comprenden una parte Fc de una inmunoglobulina confieren varias propiedades deseables a una proteína quimérica que incluyen elevada estabilidad, elevada semivida en suero (véase Capon y col. 1989, Nature 337:525) , además de unión a receptores de Fc tales como el receptor de Fc neonatal (FcRn) (patentes US 6.086.875, 6.485.726, 6.030.613; documentos WO 03/077834; US2003-0235536A1) .

El FcRn es activo en tejido epitelial adulto y se expresa en la luz de los intestinos, vías respiratorias pulmonares, superficies nasales, superficies vaginales, superficies del colon y rectales (patente US 6.485.726) . Las proteínas quiméricas que comprenden componentes de unión a FcRn (por ejemplo, IgG, fragmentos Fc) pueden transportarse eficazmente a través de barreras epiteliales por FcRn, proporcionando así un medio no invasivo para administrar sistémicamente una molécula terapéutica deseada. Adicionalmente, las proteínas quiméricas que comprenden un componente de unión a FcRn son endocitadas por células que expresan el FcRn. Pero en lugar de marcarse para la degradación, estas proteínas quiméricas se recirculan de nuevo a la circulación, aumentando así la semivida in vivo de estas proteínas.

Las partes de regiones constantes de inmunoglobulina, por ejemplo, componentes de unión a FcRn, normalmente se asocian entre sí mediante enlaces disulfuro y otras interacciones no específicas para formar dímeros y multímeros de mayor orden. La presente descripción, que incluye la presente invención, se basa en parte en el sorprendente descubrimiento de que la transcitosis de proteínas quiméricas que comprenden componentes de unión a FcRn parece estar limitada por el peso molecular de la proteína quimérica, siendo especies de mayor peso molecular transportadas al menos eficientemente.

Las proteínas quiméricas que comprenden moléculas biológicamente activas, una vez administradas, normalmente interaccionarán con una molécula diana o célula. La presente descripción, que incluye la presente invención, se basa adicionalmente en parte en el sorprendente descubrimiento de que los híbridos de monómero-dímero, con una molécula biológicamente activa, pero dos partes de una región constante de inmunoglobulina, por ejemplo, dos componentes de unión a FcRn, funcionan y puede transportarse más eficazmente que los homodímeros, también denominados en la presente memoria simplemente “dímeros” o multímeros de mayor orden con dos o más copias de la molécula biológicamente activa. Esto es debido en parte al hecho de que puede impedirse estéricamente que las proteínas quiméricas, que comprenden dos o más moléculas biológicamente activas, que existen como dímeros y multímeros de mayor orden, interaccionen con su molécula diana o célula, debido a la presencia de las dos o más moléculas biológicamente activas en estrecha proximidad entre sí y que la molécula biológicamente activa puede tener una alta afinidad for sí misma.

Por consiguiente, un aspecto de la presente descripción proporciona proteínas quiméricas que comprenden una molécula biológicamente activa que es transportada a través de la barrera del epitelio. Un aspecto adicional de la presente descripción proporciona proteínas quiméricas que comprenden al menos una molécula biológicamente activa que puede interaccionar con su molécula diana o célula con poco o ningún impedimento estérico o autoagregación.

Los aspectos de la presente descripción proporcionan proteínas quiméricas que comprenden una primera y segunda cadena de polipéptidos, comprendiendo la primera cadena al menos una parte de la región constante de inmunoglobulina, en la que la parte de una región constante de inmunoglobulina se ha modificado para incluir una molécula biológicamente activa, y comprendiendo la segunda cadena al menos una parte de región constante de inmunoglobulina, en la que la parte de una región constante de inmunoglobulina no se ha modificado así para incluir la molécula biológicamente activa de la primera cadena.

Descripción resumida de la invención La presente descripción se refiere a una proteína quimérica que comprende una molécula biológicamente activa y dos moléculas de al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina. La proteína quimérica puede interaccionar con una molécula diana o célula con menos impedimento estérico en comparación con una proteína quimérica que comprende al menos dos moléculas biológicamente activas y al menos una parte de dos regiones constantes de inmunoglobulina. La presente descripción también se refiere a una proteína quimérica que comprende al menos una molécula biológicamente... [Seguir leyendo]

1. Una proteína quimérica que comprende una primera cadena de polipéptidos y una segunda cadena de polipéptidos,

en donde dicha primera cadena de polipéptidos comprende un factor de coagulación y al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina que es un componente de unión a receptor neonatal de Fc (FcRn) , y

en donde dicha segunda cadena de polipéptidos consiste en una región constante de inmunoglobulina, o una parte de la misma, que es un componente de unión a FcRn, para su uso en un procedimiento de tratamiento.

2. La proteína quimérica de la reivindicación 1, para el uso según la reivindicación 1, en donde dichas partes de una región constante de inmunoglobulina son un fragmento Fc.

3. La proteína quimérica de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para el uso según la reivindicación 1, en donde la región constante de inmunoglobulina es una región constante de IgG1 o IgG2.

4. La proteína quimérica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para el uso según la reivindicación 1, en donde el factor de coagulación está seleccionado del grupo que consiste en factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor VIIIa, factor V, factor IX, factor IXa, factor X, factor XI, factor XII, factor XIII, fibrinógeno, protrombina y factor de von Willebrand.

5. La proteína quimérica de la reivindicación 4, para el uso según la reivindicación 1, en donde el factor de coagulación es factor IX o factor IXa.

6. La proteína quimérica de la reivindicación 4, para el uso según la reivindicación 1, en donde el factor de coagulación es factor VIII o factor VIIIa.

7. La proteína quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para el uso según la reivindicación 1, en donde la primera cadena de polipéptidos comprende además un ligador entre el factor de coagulación y la parte de una región constante de inmunoglobulina.

8. La proteína quimérica de la reivindicación 7, para el uso según la reivindicación 1, en donde el ligador comprende 1-20 aminoácidos.

9. Una composición farmacéutica que comprende la proteína quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

10. La proteína quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en el tratamiento de un trastorno hemostático.

11. La proteína quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en el tratamiento de hemofilia

A.

12. La proteína quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en el tratamiento de hemofilia B.

13. La proteína quimérica según la reivindicación 1, para el uso según la reivindicación 1, en donde la proteína quimérica va a administrarse intravenosamente, subcutáneamente, por vía oral, bucalmente, sublingualmente, nasalmente, parenteralmente, rectalmente, vaginalmente, o por una vía pulmonar.

14. La proteína quimérica según la reivindicación 1, para el uso según la reivindicación 1, en donde la proteína quimérica va a administrarse intravenosamente.

15. La proteína quimérica según la reivindicación 1, para el uso según la reivindicación 1, en donde la proteína quimérica va a administrarse subcutáneamente.

16. Un primer polinucleótido que codifica la primera cadena de polipéptidos de la proteína quimérica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un segundo polinucleótido que codifica la segunda cadena de polipéptidos de dicha proteína quimérica.

17. El primer y segundo polinucleótidos según la reivindicación 16, en donde cada uno de dichos polinucleótidos está presente en un vector de expresión.

Fig. 2A Secuencia de aminoácidos de factor VII-Fc (péptido señal subrayado, propéptido en negrita)

Fig. 2B Secuencia de aminoácidos de factor IX-Fc (péptido señal subrayado, propéptido en negrita)

Fig. 2C Secuencia de aminoácidos de IFNa-Fc (ligador de 8 aminoácidos) (secuencia señal subrayada)

Fig. 2D Secuencia de aminoácidos del ligador L de IFNa-Fc (secuencia señal subrayada)

Fig. 2E Secuencia de aminoácidos de Flag-Fc (secuencia señal subrayada)

Fig. 2F

Secuencia de aminoácidos de Epo-CCA-Fc (secuencia señal de Kb subrayada, bobina en espiral ácida en negrita)

Fig. 2G

Secuencia de aminoácidos de CCB-Fc (secuencia señal de Kb subrayada, bobina en espiral básica en negrita)

Fig. 2H Secuencia de aminoácidos de Cys-Fc (secuencia señal de hIFNa subrayada)

Fig. 2I Secuencia de proteínas de IFNa-GS15-Fc (secuencia señal subrayada)

Fig. 2J Secuencia de aminoácidos de Epo-Fc (secuencia señal subrayada, ligador en negrita)

Fig. 3A Secuencia de nucleótidos de factor VII-Fc (péptido señal subrayado, propéptido en negrita)

Fig. 3B Secuencia de nucleótidos de factor IX-Fc (péptido señal subrayado, propéptido en negrita)

Fig. 3C Secuencia de nucleótidos de IFNa-Fc (ligador de 8 aminoácidos)

Fig. 3D Secuencia de nucleótidos del ligador L de IFNa-Fc

Fig. 3E Secuencia de nucleótidos de Flag-Fc Fig. 3F

Secuencia de nucleótidos de Epo-CCA-Fc (secuencia señal de Kb subrayada, bobina en espiral ácida en negrita)

Fig. 3G

Secuencia de nucleótidos de CCB-Fc (secuencia señal subrayada, bobina en espiral básica en negrita)

Fig. 3H Secuencia de nucleótidos de Cys-Fc (secuencia señal de hIFNa subrayada)

Fig. 3I Secuencia de nucleótidos de IFNa-GS15-Fc (secuencia señal subrayada)

Fig. 3J Secuencia de nucleótidos de Epo-Fc (secuencia señal subrayada, ligador en negrita)

Figura 5a Secuencia de aminoácidos de Fc-MESNA (producidas en el vector pTWIN1 a partir de NEB; cuando Fc-inteína-CBD se eluye de perlas de quitina con MESNA produce la siguiente proteína con un tioéster del extremo C en el residuo de Phe final)

Figura 5b

Secuencia de nucleótidos de Fc-CDS en pTWIN1 (el residuo de F final, ttt, sobresale directamente contiguo a CDS de inteína de Mxe GyrA en pTWIN1)

Fig. 17a Secuencia de nucleótidos de IFN1-Fc (péptido señal subrayado)

Fig. 17b

Secuencia de aminoácidos de IFN1-Fc (péptido señal subrayado, secuencia del ligando en negrita, N297 en negrita subrayado)