Genes del virus de la fiebre aftosa que expresan avipox recombinantes.
Un vector de avipox recombinante que comprende al menos una molécula de ácido nucleico quecodifica uno o más antígeno(s) del virus de la fiebre aftosa (FMDV);
en el que el avipox es el poxvirus del canario o el poxvirus aviar;
en el que la molécula de ácido nucleico se inserta en un único sitio de inserción; y en el que la molécula de ácidonucleico que codifica uno o más antígeno(s) de FMDV está unido operativamente a una secuencia promotora endonde la secuencia promotora se ha seleccionado del grupo que consiste en el promotor I3L de vaccinia, el promotor42K del poxvirus, y el promotor H6 de vaccinia en el que el promotor H6 de vaccinia se ha mutado de forma tal quelos niveles de expresión del antígeno o antígenos de FMDV se han disminuido en comparación con los niveles deexpresión del antígeno o antígenos de FMDV incluidos en un promotor H6 de vaccinia de tipo natural;
en el que, cuando el avipox es el poxvirus del canario, el vector de avipox es ALVAC, comprende un locus deinserción C6 y la molécula de ácido nucleico se ha insertado en el locus de inserción C6 y el promotor está enorientación opuesta a las secuencias de flanqueo;
y en el que, cuando el vector de avipox es un poxvirus aviar, el vector del poxvirus aviar comprende un locus deinserción F8 y la molécula de ácido nucleico se ha insertado en el locus de inserción F8
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2005/013523.
Solicitante: MERIAL LTD..
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 3239 SATELLITE BLVD. DULUTH, GA 30096 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.
Inventor/es: LOOSMORE, SHEENA MAY, NORDGREN,ROBERT, AUDONNETT,JEAN-CHRISTOPHE FRANCIS, GRUBMAN,MARVIN J.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61K39/135 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 39/00 Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53). › Virus de la fiebre aftosa.
- C12N15/863 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Vectores poxvirales, p.ej. virus vacunal.
PDF original: ES-2424847_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Genes del virus de la fiebre aftosa que expresan avipox recombinantes
Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas [0001] Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de los Estados Unidos con Nº de serie 60/536.786 presentada el 20 de abril de 2004
Esta solicitud hace referencia a la solicitud de los Estados Unidos con Nº de serie 10/327.481, presentada el 20 de diciembre de 2002, que es una continuación de la solicitud internacional Nº PCT/FR01/02042, presentada el 27 de junio de 2001, publicada el 3 de enero de 2002 como documento WO 02/00251, y que reivindica la prioridad de la solicitud francesa Nº 00/08437, presentada el 29 de junio de 2000.
Campo [0003] La presente descripción se refiere a vectores, tales como virus, por ejemplo, virus modificados tales como poxvirus, y a los procedimientos para fabricarlos y utilizarlos. En particular, la invención se refiere a los vectores y virus avipox recombinantes que expresan antígenos del virus de la fiebre aftosa (FMDV) , y a los procedimientos para prepararlos y utilizarlos. La descripción se refiere además a los procedimientos para estimular la respuesta inmune a FMDV en un sujeto.
Antecedentes de la invención [0004] La fiebre aftosa (FMD) es una de las enfermedades más virulentas y contagiosas que afectan a losanimales de granja. Esta enfermedad es endémica en numerosos países en el mundo, especialmente en África, Asia y Sudamérica. Además, pueden producirse periódicamente brotes epidémicos. La presencia de esta enfermedad en un país puede tener consecuencias económicas muy graves resultantes de la pérdida de productividad, la pérdida de peso y producción de leche en las manadas afectadas, y de los embargos comerciales impuestos a estos países. Las medidas que se toman frente a esta enfermedad consisten en la estricta aplicación de restricciones a la importación, higiene, controles y cuarentena, sacrificio de animales enfermos y programas de vacunación que utilizan vacunas inactivadas, tanto como medida preventiva a nivel nacional o regional como de forma periódica cuando se produce un brote epidémico.
La FMD se caracteriza por su periodo de corta incubación, su naturaleza muy contagiosa, la formación de úlceras en la boca y en los pies y, algunas veces, la muerte de animales jóvenes. La FMD afecta a numerosas especies animales, en particular ganado, cerdos, ovejas y cabras. El agente responsable de esta enfermedad es un virus de ácido ribonucleico (ARN) que pertenece al género Apthovirus de la familia Picornaviridae (Cooper y col., Intervirology, 1978, 10, 165-180) . Hasta el momento se conocen al menos siete tipos de virus de la fiebre aftosa (FMDV) ; los tipos europeos (A, O y C) , los tipos africanos (SAT1, SAT2 y SAT3) y un tipo asiático (Asia 1) . Se han distinguido también numerosos subtipos (Kleid y col. Science (1981) , 214, 1125-1129) .
El FMDV es un virus icosahédrico puro de 25 nm de diámetro que contiene una molécula de ARN monocatenario que consiste en aproximadamente 8500 nucleótidos, con una polaridad positiva. Esta molécula de ARN comprende un único marco de lectura abierto (ORF) , que codifica una única poliproteína que contiene, entre otros, el precursor de la cápsida conocido también como proteína P1 o P88. La proteína P1 está miristilada en su extremo amino. Durante el proceso de maduración, la proteína P1 se escinde mediante la proteasa 3C en tres proteínas conocidas como VP0, VP1 y VP3 (o 1AB, 1D y 1C respectivamente; Belsham G. J., Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1993, 60, 241-261) . En el virión, la proteína V0 se escinde a continuación en dos proteínas, VP4 y VP2 (o 1A y 1B respectivamente) . No se conoce el mecanismo para la conversión de las proteínas VP0 en VP1 y VP3, y para la formación de viriones maduros. Las proteínas VP1, VP2 y VP3 tienen un peso molecular de aproximadamente 26.000 Da, mientras que la proteína VP4 es más pequeñas a aproximadamente 8.000 Da.
La mera combinación de las proteínas de la cápsida forma el protómero o molécula 5S, que es el constituyente elemental de la cápsida de FMVD. Este promotor se compleja a continuación en un pentámero para formar la molécula 12S. El virión es el resultado de la encapsidación de una molécula de ARN genómico mediante el ensamblaje de 12 pentámeros 12S, constituyendo de esta manera las partículas 146S. La cápsida vírica puede formarse también sin la presencia de una molécula de ARN en el interior (denominada a partir de ahora en el presente documento “cápsida vacía”) . La cápsida vacía se diseña también como una partícula 70S. La formación de las cápsidas vacías puede producirse naturalmente durante la replicación vírica o puede producirse de forma artificial mediante tratamiento químico.
Se han desarrollado muchas hipótesis, rutas de investigación, y propuestas, con la intención de diseñar vacunas eficaces contra la FMD. Actualmente, las únicas vacunas en el mercado comprenden virus inactivados. Existen riesgos acerca de la seguridad de la vacuna de la FMD, dado que brotes de FMD en Europa se han asociado con defectos en la fabricación de la vacuna (King, A.M.Q. y col, (1981) Nature 293: 479-480) . Las vacunas inactivadas no confieren inmunidad a largo plazo, requiriendo de esta manera inyecciones de refuerzo proporcionadas cada año, o con mayor frecuencia en el caso de brotes epidémicos. Además, existen riesgos relacionados con la inactivación incompleta y/o el escape del virus durante la producción de vacunas inactivadas (King, A.M.Q., ibíd) . Una meta en la técnica ha sido construir conformacionalmente inmunógenos correctos que carezcan del genoma de FMDV ineficaz para preparar vacunas eficaces y seguras.
Se ha utilizado satisfactoriamente el virus vaccinia para inmunizar contra el virus de la viruela, lo que culminó en la erradicación a nivel mundial del virus de la viruela en 1980. De esta manera, ha aparecido un nuevo papel importante para los poxvirus, el de un vector genomanipulado para la expresión de genes extraños (Panicali y Paoletti, 1982; Paoletti y col., 1984) . Se han expresado genes en vaccinia que codifican antígenos heterólogos, dando como resultado a menudo una inmunidad protectora frente al estímulo debido al patógeno correspondiente (revisado en Tartaglia y col., 1990) . Se ha utilizado también una cepa muy atenuada de vacunas, designada como MVA, para vacunas basadas en poxvirus. El uso de MVA se ha descrito en la patente de los Estados Unidos Nº
5.185.146.
Los sistemas de vectores de vacunas adicionales implican el uso de virus avipox que son poxvirus restringidos de forma natural a un hospedador. El virus de la viruela aviar (FPC; Taylor y col. 1988a, b) y el virus de la viruela del canario (CPV; Taylor y col., 1991 y 1992) se han genomanipulado para expresar productos génicos extraños. El virus de la viruela aviar (FPV) es el virus prototípico del género Avipox de la familia Poxvirus. El virus produce una enfermedad económicamente importante de las aves de corral que se ha controlado bien desde los años 20 del siglo XX mediante el uso de vacunas atenuadas vivas. La replicación de los virus avipox está limitada a especies de aves (Matthews, 1982) , y no existen informes en la bibliografía de un virus avipox que produzca una infección productiva en cualquier especie no de ave, incluyendo el hombre. Esta restricción del hospedador proporciona una barrera de seguridad inherente frente a la trasmisión del virus a otras especies y hace que el uso del virus avipox basado en vectores de vacuna en aplicaciones veterinarias y humanas una proposición atractiva.
Se han preparado otros vectores de poxvirus atenuados mediante modificaciones genéticas de cepas naturales de virus. El vector NYVAC, derivado por deleción de virulencia específica y los genes de la gama de hospedadores de la cepa Copenhagen de vaccinia (Tartaglia y col., 1992) han demostrado ser útiles como un vector recombinante en la estimulación de una respuesta inmunoprotectora frente a un antígeno extraño expresado. Otro vector de poxvirus genomanipulado es ALVAC, derivado del virus de la viruela del canario (véase la patente de los Estados Unidos Nº 5.756.103) . ALVAC no se replica de forma productiva en hospedadores no de ave, una característica que se piensa que mejora su perfil de seguridad (Taylor y col., 1991 y 1992) . ALVAC se ha depositado bajo los términos del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection con el número de acceso VR2547. Otro vector más de poxvirus genomanipulado es TROVAC, derivado del virus de la viruela aviar (véase la Patente de los Estados Unidos Nº 5.766.599) .
Se pueden construir poxvirus recombinantes en dos etapas conocidas en la técnica y análogas... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Un vector de avipox recombinante que comprende al menos una molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígeno (s) del virus de la fiebre aftosa (FMDV) ;
en el que el avipox es el poxvirus del canario o el poxvirus aviar;
en el que la molécula de ácido nucleico se inserta en un único sitio de inserción; y en el que la molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígeno (s) de FMDV está unido operativamente a una secuencia promotora en donde la secuencia promotora se ha seleccionado del grupo que consiste en el promotor I3L de vaccinia, el promotor 42K del poxvirus, y el promotor H6 de vaccinia en el que el promotor H6 de vaccinia se ha mutado de forma tal que los niveles de expresión del antígeno o antígenos de FMDV se han disminuido en comparación con los niveles de expresión del antígeno o antígenos de FMDV incluidos en un promotor H6 de vaccinia de tipo natural;
en el que, cuando el avipox es el poxvirus del canario, el vector de avipox es ALVAC, comprende un locus de inserción C6 y la molécula de ácido nucleico se ha insertado en el locus de inserción C6 y el promotor está en orientación opuesta a las secuencias de flanqueo;
y en el que, cuando el vector de avipox es un poxvirus aviar, el vector del poxvirus aviar comprende un locus de inserción F8 y la molécula de ácido nucleico se ha insertado en el locus de inserción F8
2. El vector de avipox de la reivindicación 1, en el que el antígeno se ha seleccionado del grupo que consiste en VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, y 3C de FMDV.
3. El vector de avipox de la reivindicación 1, en el que la molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígeno (s) del virus de la fiebre aftosa (FMDV) es un ADNc que codifica una región P1 de FMDV y un ADNc que codifica una proteasa 3C de FMDV.
4. El vector de avipox de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que dicho promotor H6 de vaccinia mutado comprende la secuencia mostrada en la Figura 11.
5. El vector de avipox de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que cuando el vector de avipox es ALVAC que comprende un locus de inserción C6, las secuencias de flanqueo del locus de inserción C6 promueven la recombinación homóloga de los antígenos de FMDV con el locus de inserción C6.
6. El vector de avipox de la reivindicación 5, en el que las secuencias de flanqueo comprenden las regiones de marco de lectura abierto C6L y C6R de avipox.
7. El vector de avipox de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que cuando el vector de avipox es un poxvirus aviar vector que comprende un locus de inserción F8, las secuencias de flanqueo del locus de inserción F8 promueven la recombinación homóloga de los antígenos de FMDV con el locus de inserción F8.
8. El vector de avipox de la reivindicación 7, en el que las secuencias de flanqueo comprenden las regiones de marco de lectura abierto F8L y F8R de avipox.
9. Un vector de avipox recombinante que comprende al menos una molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígeno (s) s del virus de la fiebre aftosa (FMDV) ;
en el que el avipox es el poxvirus del canario o el poxvirus aviar;
en el que la molécula de ácido nucleico se inserta en un único sitio de inserción; y en el que la molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígeno (s) de FMDV está unido operativamente a una secuencia promotora en donde la secuencia promotora se ha seleccionado del grupo que consiste en el promotor I3L de vaccinia, el promotor 42K del poxvirus, y el promotor H6 de vaccinia en el que el promotor H6 de vaccinia se ha mutado de forma tal que los niveles de expresión del antígeno o antígenos de FMDV se han disminuido en comparación con los niveles de expresión del antígeno o antígenos de FMDV incluidos en un promotor H6 de vaccinia de tipo natural;
en el que, cuando el avipox es el poxvirus del canario, el vector de avipox es ALVAC, comprende un locus de inserción C6 y la molécula de ácido nucleico se ha insertado en el locus de inserción C6 y el promotor está en orientación opuesta a las secuencias de flanqueo;
y en el que, cuando el vector de avipox es un poxvirus aviar, el vector del poxvirus aviar comprende un locus de inserción F8 y la molécula de ácido nucleico se ha insertado en el locus de inserción F8
10. El virus avipox de la reivindicación 9, en el que el antígeno se ha seleccionado del grupo que consiste en VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, y 3C de FMDV.
11. El virus avipox de la reivindicación 9 o 10, en el que la molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígeno (s) s del virus de la fiebre aftosa (FMDV) es un ADNc que codifica una región P1 de FMDV y un ADNc que codifica una proteasa 3C de FMDV.
12. El virus avipox de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 en el que dicho promotor H6 de vaccinia mutado comprende la secuencia mostrada en la Figura 11.
13. El virus avipox de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que cuando el vector de avipox es ALVAC que comprende un locus de inserción C6, las secuencias de flanqueo del locus de inserción C6 promueven la recombinación homóloga de los antígenos de FMDV con el locus de inserción C6.
14. El vector de avipox de la reivindicación 13, en el que las secuencias de flanqueo comprenden las regiones de marco de lectura abierto C6L y C6R de avipox.
15. El virus avipox de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que el vector de avipox es un poxvirus aviar que comprende un locus de inserción F8, las secuencias de flanqueo del locus de inserción F8 promueven la recombinación homóloga de los antígenos de FMDV con el locus de inserción F8.
16. El vector de avipox de la reivindicación 15, en el que las secuencias de flanqueo comprenden las regiones de marco de lectura abierto F8L y F8R de avipox.
17. Uso de un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en la preparación de un medicamento para desencadenar una respuesta inmune frente a FMDV en un sujeto.
18. Uso de un virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16 en la preparación de un medicamento para desencadenar una respuesta inmune frente a FMDV en un sujeto.
19. Un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 a usar para desencadenar una respuesta inmune frente a FMDV en un sujeto.
20. A virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16 para desencadenar una respuesta inmune frente a FMDV en un sujeto.
21. Uso de un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o profilaxis de una infección por FMDV; y/o tratar y/o prevenir la fiebre aftosa.
22. Uso de un virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16 en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o profilaxis de una infección por FMDV; y/o tratar y/o prevenir la fiebre aftosa.
23. Un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 a utilizar en el tratamiento y/o profilaxis de una infección por FMDV; y/o tratar y/o prevenir la fiebre aftosa.
24. Un virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16 a utilizar en el tratamiento y/o profilaxis de una infección por FMDV; y/o tratar y/o prevenir la fiebre aftosa.
25. Un procedimiento para producir un vector de avipox recombinante que comprende al menos una molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígeno (s) s del virus de la fiebre aftosa (FMDV) , que comprende las etapas de:
(a) linealizar un plásmido donante con una endonucleasa de restricción, en el que el plásmido donante comprende sitios de escisión de la endonucleasa de restricción o un sitio de clonación múltiple; y
(b) unir al menos una molécula de ácido nucleico que comprende
(i) una secuencia de ácido nucleico codifica uno o más antígeno (s) de FMDV,
(ii) una secuencia de un promotor vírico, y
(iii) secuencias de inserción que flanquean (i) y (ii) que tienen sitios de escisión de la endonucleasa de restricción complementarios del plásmido donante en los antígenos de FMDV,
produciendo de esta forma el vector de avipox recombinante; en el que el avipox es poxvirus del canario o poxvirus aviar;
en el que la molécula de ácido nucleico está insertada en un único sitio de inserción; y en el que la molécula de ácido nucleico está unida operativamente a una secuencia promotora en donde la secuencia promotora se ha seleccionado del grupo que consiste en el promotor I3L de vaccinia, el promotor 42K poxviral y el promotor H6 de vaccínica en el que el promotor H6 de vaccinia se ha mutado de forma tal que los niveles de expresión del antígeno o antígenos de FMDV se han disminuido en comparación con los niveles de expresión del antígeno o antígenos de FMDV incluidos en un promotor H6 de vaccinia de tipo natural;
y
en el que, cuando el avipox es el poxvirus del canario, el vector de avipox es ALVAC, comprende un locus de inserción C6 y la molécula de ácido nucleico se ha insertado en el locus de inserción C6 y el promotor está en orientación opuesta a las secuencias de flanqueo;
y en el que, cuando el vector de avipox es un poxvirus aviar, el vector del poxvirus aviar comprende un locus de inserción F8 y la molécula de ácido nucleico se ha insertado en el locus de inserción F8.
26. El procedimiento de la reivindicación 25, que comprende además las etapas de:
(c) introducir el vector en una célula que permita la replicación del vector; y
(d) aislar el vector de la célula.
27. El procedimiento de la reivindicación 25 o 26, en el que el antígeno comprende al menos uno de VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, y 3C de FMDV.
28. El procedimiento de la reivindicación 25 o 26, en el que la molécula de ácido nucleico que codifica uno
o más antígeno (s) s del virus de la fiebre aftosa (FMDV) es un ADNc que codifica una región P1 de FMDV y un ADNc que codifica una proteasa 3C de FMDV.
29. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, en el que cuando el vector de avipox es ALVAC que comprende un locus de inserción C6, las secuencias de flanqueo del locus de inserción C6 promueven la recombinación homóloga de los antígenos de FMDV con el locus de inserción C6.
30. El procedimiento de la reivindicación 29, en el que las secuencias de flanqueo comprenden las regiones de marco de lectura abierto C6L y C6R de avipox.
31. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, en el que cuando el vector de avipox es un poxvirus aviar vector que comprende un locus de inserción F8, las secuencias de flanqueo del locus de inserción F8 promueven la recombinación homóloga de los antígenos de FMDV con el locus de inserción F8..
32. El procedimiento de la reivindicación 31, en el que las secuencias de flanqueo comprenden las regiones de marco de lectura abierto F8L y F8R de avipox.
33. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 32, en el que el vector comprende además un gen indicador.
34. El procedimiento de la reivindicación 33, en el que el gen indicador se ha seleccionado del grupo que consiste en gen de resistencia a la neomicina, gen de resistencia a la ampicilina, lacZ ( -galactosidasa) , luciferasa, y proteína de fluorescencia verde (GFP) .
35. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 32, en el que la célula que permite el crecimiento del vector es un fibroblasto embriónico de pollo.
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