Dispositivos de mezclado para la lisis química de células.

Un proceso de lisis que comprende las etapas de:

proporcionar un flujo de solución de lisis en una primera dirección;



proporcionar un flujo de uno o más fluidos adicionales en una dirección diferente a la dirección del flujo de la solución de lisis;

en el que al menos uno de los fluidos adicionales comprende células suspendidas que producen y contienen compuestos biológicos de interés como proteínas, ARN, ADN, virus y fagos;

en el que el flujo combinado de la solución de lisis y al menos uno de los fluidos adicionales induce fuerzas de cizallamiento y turbulencias;

en el que la solución de lisis y las células se someten a un cizallamiento intenso durante un breve periodo de tiempo de menos de segundos para mezclar la solución de lisis con las células y lisar las células sin una desnaturalización permanente de los compuestos biológicos de interés; en el que los compuestos biológicos de interés incluyen proteínas, ARN, ADN, virus y fagos;

en el que la intensidad del cizallamiento es suficiente para causar un mezclado sustancialmente completo de la solución y dichos fluidos y en el que la relación de las velocidades lineales del uno o más fluidos adicionales con la velocidad lineal de la solución de lisis es de 100 a 15 000; y

hacer pasar un fluido combinado resultante de la solución de lisis que se mezcla con el uno o más fluidos adicionales que comprenden las células biológicas a través de un reductor de vórtices para reducir o eliminar cualquier velocidad rotacional o cualquier componente tórico del flujo y obtener un flujo laminar.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2005/042797.

Solicitante: MERIAL LTD..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 3239 SATELLITE BLVD. DULUTH, GA 30096 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: RIGAUT, GUILLAUME, DETRAZ,NOËL JOSEPH FRANÇOIS.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N1/06 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › Lisis de microorganismos.
  • C12P1/00 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.Preparación de compuestos o de composiciones, no prevista en los grupos C12P 3/00 - C12P 39/00, utilizando microorganismos o enzimas; Procedimientos generales de preparación de compuestos o composiciones que utilizan microorganismos o enzimas.

PDF original: ES-2529675_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Dispositivos de mezclado para la lisis química de células

CAMPO DE LA INVENCIÓN 5

La presente descripción se refiere a dispositivos de flujo para el mezclado de fluidos, en especial soluciones de lisis y fluidos que contienen células que se desea lisar. La presente invención proporciona procedimientos de flujo para mezclar y para lisar células con la finalidad de liberar compuestos biológicos de interés. Específicamente, la presente invención se refiere a procedimientos de flujo para mezclar y procedimientos químicos 10 para lisar células y liberar plásmidos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En el campo de la tecnología de ácidos desoxirribonucleicos (ADN) recombinantes, los plásmidos son 15 muy utilizados para codificar y expresar proteínas heterólogas de interés.

Recientemente, se ha demostrado que el ADN plasmídico puede ser útil para aplicaciones clínicas, como terapia génica e inmunización genética (Wolf y col., Science, 1990, 247, 1465-1468; WO-A-90/11092) .

Los plásmidos son demasiado grandes y complejos como para producirse en cantidades grandes a través de medios sintéticos. En cambio, los plásmidos se pueden producir en células y, posteriormente, se pueden extraer, recoger y purificar. En general, los plásmidos se pueden producir a través de la fermentación bacteriana y recuperarse mediante rotura de la célula. Los expertos en la materia conocen las técnicas de fermentación. Se han publicado muchas de estas técnicas y se utilizan de forma rutinaria (p. ej., Sambrook y col., sección 1.21, 25 "Extracción y purificación de ADN plasmídico", Molecular Cloning: a laborator y manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laborator y Press, 1989) . Estos procedimientos suponen el crecimiento del cultivo bacteriano y la replicación del plásmido, recogida y lisis de las bacterias, y el aislamiento y purificación del ADN plasmídico.

En consecuencia, existe la necesidad de procesos a gran escala para la extracción y recuperación del 30 ADN plasmídico superenrollado.

Se dispone de una gran variedad de técnicas de rotura celular entre las que se incluyen procedimientos mecánicos o físicos (p. ej., altas presiones, sonicación, tratamientos de calor) , químicos (p. ej., detergentes no iónicos, detergentes iónicos, solventes orgánicos, bases) o enzimáticos (p. ej., lisozima) . 35

Para usos farmacéuticos y de inmunización, en las composiciones de ADN plasmídico se deben evitar la presencia de impurezas, como ADN genómico, endotoxinas y ARNt (ácidos ribonucleicos de transferencia) o ARNr (ácidos ribonucleicos ribosómicos) , así como la reducción del rendimiento debido a una degradación del plásmido y a la baja eficacia del procedimiento de extracción. 40

Puesto que el ADN plasmídico superenrollado normalmente se separa tanto del ADN genómico más grande de la célula huésped como de los ADN y ARN celulares más pequeños en función de su tamaño, es importante evitar el corte por cizallamiento del ADN plasmídico o del ADN genómico. Las fuerzas de cizallamiento pueden dañar los ADN genómicos y producir ADN genómicos con el mismo tamaño que los ADN plasmídicos. Las 45 fuerzas de cizallamiento también pueden cortar los ADN plasmídicos y producir ADN plasmídicos linealizados. Los ADN plasmídicos linealizados y los fragmentos de ADN genómico similares en cuanto a tamaño a los ADN plasmídicos superenrollados pueden ser especialmente difíciles de separar de los ADN plasmídicos superenrollados.

Para usos farmacéuticos y de inmunización, es preferible utilizar ADN plasmídicos superenrollados, 50 que son más pequeños y compactos que los ADN plasmídicos circulares cerrados relajados y menos vulnerables a la degradación enzimática. Las técnicas de rotura celular pueden dañar los ADN plasmídicos superenrollados y producir ADN plasmídicos fragmentados, linealizados o circulares cerrados, lo que aumenta el nivel de impurezas y reduce el rendimiento de ADN plasmídicos superenrollados.

Se utilizan habitualmente varias técnicas de rotura celular para liberar un producto intracelular, especialmente proteínas intracelulares.

Las técnicas de rotura celular se clasifican en dos categorías principales: la primera implica solo fuerzas

físicas para romper las células y la segunda implica el contacto de las células con agentes químicos o enzimáticos y la destrucción de la membrana, cápsula o pared celular.

Las fuerzas físicas implicadas en la primera categoría pueden ser:

- altas presiones o altas temperaturas (p. ej., gracias a técnicas de microfluidificación, nebulización o tratamiento de calor) ,

- cavitación (p. e., gracias a técnicas de sonicación) ,

- impactos contra sólidos (p. ej., gracias a técnicas de molido con microesferas) (véase p. ej., la patente de EE. UU. Nº 6.455.287; Agerkvist I. y col., Biotechnol. Bioeng., 1990, 36, 1083-1089; el documento. US-A-10 6.071.480) .

La rotura de la célula depende de las condiciones del tiempo de residencia, presión, temperatura, velocidad de agitación, fuerzas de cizallamiento, fuerzas de impacto. etc. Estas condiciones son difíciles de controlar y monitorizar. Fuerzas físicas demasiado débiles pueden no romper todas las células y tener como consecuencia un 15 rendimiento subóptimo de ADN plasmídicos. Fuerzas físicas demasiado fuertes pueden dañar los ADN libres y dar lugar a la fragmentación del ADN, la creación de un nivel inaceptable de impurezas y la reducción en la producción de ADN plasmídicos superenrollados.

En la segunda categoría de las técnicas de rotura celular, la lisis enzimática o química de las células implica 20 el mezclado de la suspensión celular y la solución de lisis. Esto constituye el campo técnico de la presente invención. El mezclado de la suspensión celular y la solución de lisis es un paso crucial. Los mezclados incompletos, en particular debido a tiempos demasiado cortos de mezclado, pueden tener como consecuencia la lisis incompleta de las células y la pérdida parcial del compuesto biológico de interés, dando lugar a una producción subóptima. Por el contrario, un tiempo de mezclado demasiado largo puede tener como consecuencia un contacto demasiado largo 25 entre las células y la solución de lisis, dar lugar a la degradación del compuesto biológico de interés y de los ADN genómicos y producir fragmentos de ADN genómico con el mismo tamaño que los ADN plasmídicos. Ambas situaciones incrementarán los costes del compuesto biológico final de interés. Se reconoce en la técnica previa que para permitir una recuperación completa de ADN plasmídicos superenrollados, las condiciones de procesamiento deben ser muy suaves, especialmente en lo que se refiere a las fuerzas de cizallamiento durante la etapa de 30 mezclado.

En el documento US-A-6.197.553 se describe la lisis enzimática con lisozima y el tratamiento con calor mediante un intercambiador de calor. Esta técnica tiene la desventaja de que usa dos tipos de enzimas (lisozima y ARNasa) y que las enzimas son de origen animal, lo que podría conducir a posibles problemas de seguridad debido 35 a contaminación, entre otros, por priones. Otra desventaja de esta técnica es que las enzimas se deben desechar posteriormente. Esto supone varias etapas de purificación, en particular, cromatografía de intercambio iónico en gradiente y cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa en gradiente.

Para automatizar los procedimientos para la purificación de ADN plasmídicos a partir de células, se ha 40 propuesto previamente pasar de forma continua la suspensión celular que se desea lisar con una solución de lisis a través de un mezclador estático (documento WO-A-00/05358) . Normalmente, los mezcladores estáticos contienen una estructura helicoidal interna que permite que la suspensión celular y la solución de lisis se pongan en contacto en un flujo giratorio opuesto que les fuerza a mezclarse en un flujo turbulento o laminar. Dichos mezcladores se describen, por ejemplo, en los documentos WO-A-00/05358 y US-A-5.837.529. La técnica que usa el mezclador 45 estático es difícil de llevar a mayor escala debido a las limitaciones del tamaño del diámetro interno y a los caudales.

Otros autores proponen el paso continuo de la suspensión celular que se desea lisar y una solución de lisis a través de un tubo común (véase el documento US-A-6.664.049) . Una de las principales desventajas de esta técnica es la gran dificultad para llevar a mayor escala debido al pequeño tamaño del diámetro interno del tubo. La 50 solución descrita en esta patente no es para llevar a mayor escala el proceso, sino para multiplicar los tubos para aumentar... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un proceso de lisis que comprende las etapas de:

proporcionar un flujo de solución de lisis en una primera dirección; 5

proporcionar un flujo de uno o más fluidos adicionales en una dirección diferente a la dirección del flujo de la solución de lisis;

en el que al menos uno de los fluidos adicionales comprende células suspendidas que producen y contienen compuestos biológicos de interés como proteínas, ARN, ADN, virus y fagos;

en el que el flujo combinado de la solución de lisis y al menos uno de los fluidos adicionales induce fuerzas de 10 cizallamiento y turbulencias;

en el que la solución de lisis y las células se someten a un cizallamiento intenso durante un breve periodo de tiempo de menos de 10 segundos para mezclar la solución de lisis con las células y lisar las células sin una desnaturalización permanente de los compuestos biológicos de interés; en el que los compuestos biológicos de interés incluyen proteínas, ARN, ADN, virus y fagos; 15

en el que la intensidad del cizallamiento es suficiente para causar un mezclado sustancialmente completo de la solución y dichos fluidos y en el que la relación de las velocidades lineales del uno o más fluidos adicionales con la velocidad lineal de la solución de lisis es de 100 a 15 000; y hacer pasar un fluido combinado resultante de la solución de lisis que se mezcla con el uno o más fluidos adicionales que comprenden las células biológicas a través de un reductor de vórtices para reducir o eliminar 20 cualquier velocidad rotacional o cualquier componente tórico del flujo y obtener un flujo laminar.

2. El proceso de la reivindicación 1, en el que dicho mezclado crea vórtices que maximizan la exposición del material en que se va a realizar la lisis a la solución de lisis.

3. El proceso de la reivindicación 1, en el que la solución de lisis y el uno o más fluidos adicionales tienen caudales continuos.

4. El proceso de la reivindicación 1, en el que al menos una proporción de las células lisadas se lisan dentro de una zona de mezclado. 30

5. El proceso de la reivindicación 1, en el que la solución de lisis y el uno o más fluidos adicionales se mezclan durante menos de 5 segundos.

6. El proceso de la reivindicación 1, en el que la solución de lisis y el uno o más fluidos adicionales se 35 mezclan durante menos de 2 segundos.

7. El proceso de la reivindicación 1, en el que el reductor de vórtices se localiza en un conducto y comprende una sección adaptada a la sección del conducto con varios agujeros rectilíneos paralelos al eje longitudinal del conducto. 40


 

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