Fragmento scFv anti-glicoproteína VI para el tratamiento de la trombosis.

Un fragmento variable de cadena sencilla humanizado dirigido contra la glicoproteína VI humana,

quecomprende:

- un dominio VH que comprende las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 constituidas por SEQ ID NO: 2, SEQ IDNO: 3 y SEQ ID NO: 4,

- un enlazador peptídico, y

- un dominio VL que comprende las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 constituidas por SEQ ID NO: 5, SEQ IDNO: 6 y SEQ ID NO: 7

en el que las regiones armazón de los dominios VH y VL se han sustituido por los dominios VH y VL que tienenregiones armazón de un anticuerpo humano, en donde dicho fragmento variable de cadena sencilla humanizadotiene una afinidad superior hacia GPVI-Fc en comparación con el Fab de ratón correspondiente que es de 4,5 10-9 Mcomo se determina por resonancia de plasmones superficiales.

Fragmento scFv anti-glicoproteína VI para el tratamiento de la trombosis

Campo técnico

La presente invención se refiere a un fragmento variable de cadena sencilla (scFv 9O12.2) dirigido contra la glicoproteína VI humana, constituido por los dominios VH y VL del anticuerpo monoclonal 9O12.2 unidos a través de un péptido (Gly4Ser) 3 y seguido de un marcador "c-myc", representado por SEQ ID NO: 1. La invención también se refiere a variantes funcionales de dicho fragmento scFv 9O12.2 con regiones determinantes de la complementariedad 1, 2 y 3 con cadenas pesada y ligera idénticas, y preferentemente a variantes funcionales humanizadas tales como los fragmentos scFv humanizados representados por SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 47. La invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican un fragmento scFv de este tipo, a vectores de expresión y a células hospedadoras para producir un fragmento scFv de este tipo, así como a usos terapéuticos de un fragmento scFv de este tipo.

Técnica anterior

Los accidentes coronarios y cerebrovasculares agudos son actualmente la primera causa de muerte en el mundo. Además, la incidencia global de recidiva y muerte en el período de 6 meses posteriores al tratamiento, después de un síndrome coronario agudo, sigue siendo del 8-15%. En el caso de síndrome coronario agudo con elevación del segmento ST, el tratamiento mecánico con angioplastia coronaria e introducción de una endoprótesis vascular es muy eficaz para restaurar urgentemente el flujo de la arteria coronaria, pero no impide una morbilidad/mortalidad en aproximadamente el 15% de los pacientes en los 6 meses siguientes.

Los tratamientos trombolíticos, que se basan en asociaciones a largo plazo de fármacos fibrinolíticos, anticoagulantes y antiagregación, proporcionan unos resultados aún menos alentadores. En efecto, a pesar de las mejoras en el tratamiento médico de la trombosis, la morbilidad/mortalidad a los 6 meses es similar a la observada para el síndrome coronario agudo sin elevación del segmento ST.

En cuanto a los accidentes cerebrovasculares isquémicos, los tratamientos siguen siendo muy limitados debido, en general, a una atención médica con retraso de la mayoría de los pacientes y al riesgo hemorrágico de los tratamientos antitrombóticos disponibles actualmente.

Por ello, existe una auténtica necesidad clínica apremiante de mejorar los tratamientos de las enfermedades cardiovasculares y, en especial, de nuevas moléculas con características mejoradas en comparación con las moléculas disponibles, en particular de moléculas con un efecto hemorrágico reducido.

Las interacciones entre plaquetas-colágeno son decisivas en la aparición de una trombosis arterial aguda y en la remodelación vascular postrombótica. Se ha mostrado en animales que la glicoproteína VI (GPVI) , el receptor principal para la activación de las plaquetas a través de colágeno, tiene una función en la trombosis experimental, la remodelación vascular, la aterotrombosis y la isquemia miocárdica aguda.

Al contrario que los antagonistas de la integrina aIIbº3, que se utilizan actualmente en el tratamiento de la trombosis e inhiben la fase de activación final de las plaquetas, la GPVI está implicada en la fase de activación inicial de las plaquetas y, por lo tanto, los antagonistas de GPVI deben evitar no solo la agregación de plaquetas, sino también la liberación de agonistas secundarios y la secreción de factores de crecimiento y de citocinas que da como resultado el desarrollo de lesiones vasculares. Además, un déficit de GPVI no está asociado con un riesgo hemorrágico elevado, lo que constituye una característica decisiva para la seguridad del paciente. Por último, la expresión de GPVI se limita a las plaquetas, y por lo tanto representa una diana perfectamente específica para el tratamiento antitrombosis.

Por ello, los antagonistas de GPVI deben ser eficaces para prevenir específica y eficazmente la trombosis primaria o secundaria, a la vez que implican solo un riesgo hemorrágico bajo.

Se han generado diversos tipos de antagonistas potenciales de GPVI. En un método, se ha generado una proteína recombinante soluble de GPVI, que es una proteína de fusión entre el dominio extracelular de GPVI y el dominio Fc de Ig humana (véase, por ejemplo, el documento WO 01/00810 (1) y WO 03/008454 (2) ) . Por tanto, la proteína GPVI recombinante soluble compite con la GPVI de las plaquetas en la unión al colágeno. Unos resultados alentadores se obtuvieron en primer lugar con esta proteína GPVI soluble en un modelo de ratón de trombosis (3) , pero estos resultados no se confirmaron (4) . Además, este método implica desventajas estructurales, funcionales y farmacológicas. En primer lugar, este compuesto es una proteína de peso molecular elevado (~160 kDa) , cuya semivida se espera que sea corta. Puesto que GPVI contiene al menos un sitio de escisión para proteasas, se tiene que considerar la hidrólisis de la proteína GPVI-Fc soluble recombinante. Cuando se une al colágeno, la proteína expondrá su dominio Fc a la corriente sanguínea. Las plaquetas humanas (pero no las plaquetas de ratones) y los leucocitos expresan el receptor de baja afinidad de Fc (FcyRIIA) en su superficie. La reticulación del FcyRIIA de las plaquetas con GPVI-Fc inmovilizada es susceptible de activar las plaquetas y, por lo tanto, de tener un efecto opuesto al esperado. El momento y la dosis con la que se debe administrar la proteína, también causan problemas.

Una vez unidas al colágeno, las plaquetas se activan de forma rápida e irreversible. Por lo tanto, para ser eficaz, GPVI-Fc se tiene que administrar antes de la activación de las plaquetas, es decir, antes del evento trombótico, una situación poco frecuente en la medicina actual. Por otra parte, la cantidad de proteína que debe ser administrada variará en función del tamaño y la naturaleza de la lesión vascular, un parámetro imposible de predecir.

Muchos otros han tratado de desarrollar anticuerpos monoclonales neutralizantes dirigidos contra la GPVI humana. Por ejemplo, en los documentos EP 1224942 (5) y EP 1228768 (6) se describe un anticuerpo monoclonal anti-GPVI, JAQ1, que se une específicamente a la GPVI de ratón, para el tratamiento de la enfermedad trombótica. El anticuerpo JAQ1 induce la internalización irreversible del receptor de GPVI en las plaquetas de ratón.

El documento EP1538165 (7) describe otro anticuerpo monoclonal anti-GPVI, hGP 5C4, cuyo fragmento Fab tenía unos efectos inhibitorios notables sobre las principales funciones fisiológicas de las plaquetas inducidas por la estimulación con colágeno: la estimulación de parámetros de la activación fisiológica mediados por colágeno, PAC-1 y CD 62P-selectina estaba completamente obstaculizada por Fab hGP 5C4, y Fab hGP 5C4 inhibía fuertemente la agregación plaquetaria humana ex vivo sin ninguna actividad intrínseca.

El documento WO 2005/111083 (8) describe 4 anticuerpos monoclonales anti-GPVI, OM1, OM2, OM3 y OM4, que inhibían la unión de GPVI al colágeno, la secreción inducida por colágeno y la formación de tromboxano A2 (TXA2) in vitro, así como la agregación de plaquetas inducida por colágeno ex vivo, después de una inyección intravenosa a monos Cynomolgus. OM4 también parece inhibir la formación de trombos en un modelo de trombosis en rata.

El documento WO 01/00810 (1) también describe diversos anticuerpos monoclonales anti-GPVI, denominados 7I20.2, 8M14.3, 3F8.1, 9E18.3, 3J24.2, 6E12.3, 1P10.2, 4L7.3, 7H4.6, 9O12.2, 7H14.1 y 9E18.2, así como varios fragmentos scFv denominados A9, A10, C9, A4, C10, B4, C3 y D11. Algunos de estos anticuerpos y fragmentos scFv inhibían la unión de GPVI a colágeno, incluyendo los anticuerpos 8M14.3, 3F8.1, 9E18.3, 3J24.2, 6E12.3, 1P10.2, 4L7.3, 7H4.6 y 9O12.2, y los fragmentos scFv A10, A4, C10, B4, C3 y D11.

Además, se encontraron fragmentos Fab 9O12.2 que bloqueaban completamente la agregación y la secreción plaquetaria inducida por colágeno, al inhibir la actividad procoagulante de las plaquetas estimuladas con colágeno y la adhesión de las plaquetas al colágeno en condiciones estáticas, al impedir la adhesión plaquetaria y al evitar la formación de trombos en condiciones de flujo arterial (9) .

Sin embargo, ninguno de los anticuerpos anti-GPVI conocidos en la actualidad ha mostrado ser realmente eficaz in vivo en la prevención y/o tratamiento de enfermedades cardiovasculares que implican agregación plaquetaria, tales como la trombosis arterial y venosa, la reestenosis, el síndrome coronario agudo, y los accidentes cerebrovasculares debidos a ateroesclerosis. Hasta hace poco, los diferentes anticuerpos anti-GPVI que han sido descritos, no parecían adecuados... [Seguir leyendo]

1. Un fragmento variable de cadena sencilla humanizado dirigido contra la glicoproteína VI humana, que comprende:

- un dominio VH que comprende las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 constituidas por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4,

- un enlazador peptídico, y

- un dominio VL que comprende las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 constituidas por SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7

en el que las regiones armazón de los dominios VH y VL se han sustituido por los dominios VH y VL que tienen regiones armazón de un anticuerpo humano, en donde dicho fragmento variable de cadena sencilla humanizado tiene una afinidad superior hacia GPVI-Fc en comparación con el Fab de ratón correspondiente que es de 4, 5 10-9 M como se determina por resonancia de plasmones superficiales.

2. Un fragmento variable de cadena sencilla según la reivindicación 1, que comprende además un marcador peptídico y, opcionalmente, un espaciador peptídico corto.

3. Un fragmento variable de cadena sencilla según la reivindicación 2, que comprende o consiste en una secuencia de 266 aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad con SEQ ID NO: 1, en la que los aminoácidos 26 a 35, 50 a 66, 99 a 109, 159 a 174, 190 a 196 y 229 a 237 de dicha secuencia de 266 amino ácidos están constituidos por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7, respectivamente.

4. Un fragmento variable de cadena sencilla según la reivindicación 3, que comprende o consiste en SEQ ID NO: 1.

5. Un fragmento variable de cadena sencilla humanizado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende o consiste en SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 47.

6. Una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento variable de cadena sencilla según cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. Una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende o consiste en SEQ ID NO: 29.

8. Una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende o consiste en SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 49.

9. Un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 6-8.

10. Una célula hospedadora que comprende un vector de expresión según la reivindicación 9.

11. Un método para preparar un fragmento variable de cadena sencilla según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende:

a) cultivar una célula hospedadora según la reivindicación 10, y

b) purificar dicho fragmento variable de cadena sencilla.

12. Un fragmento variable de cadena sencilla según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para uso como medicamento.