Eritropoyetina glicopegilada.

Un péptido de eritropoyetina que comprende el resto:**Fórmula**

en donde

D es un miembro seleccionado entre 5 -OH y R1-L-HN-;

G es un miembro seleccionado entre R1-L- y -C(O)alquilo (C1-C6);

R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado entre:**Fórmula**

Eritropoyetina glicopegilada Antecedentes de la invención La eritropoyetina (EPO) es una citoquina producida por el riñón y el hígado que actúa sobre las células madre hematopoyéticas para estimular la producción de glóbulos rojos. La proteína existe en dos formas: una que es un péptido de 165 aminoácidos, y la otra es un péptido de 166 aminoácidos. El péptido de 166 aminoácidos tiene la misma secuencia que el péptido de 165 aminoácidos excepto en que el péptido de 166 aminoácidos tiene una arginina adicional en la posición más terminal del C. El péptido de 165 aminoácidos maduro es una glicoproteína de 34 kD que comprende tres sitios de N-glicosilación (Asn-24, Asn-38, y Asn-83) , y 1 sitio de O-glicosilación (Ser-126) , y algunas variantes están "hiperglicosiladas" comprendiendo 5 sitios de glicosilación unidos a N.

La síntesis de eritropoyetina está inducida por condiciones que crean hipoxia tisular de forma eficaz, tal como disminución de la tensión de O2 arterial o el aumento de la afinidad del oxígeno de la sangre. En condiciones normales de homeostasis, el hematocrito y la concentración de hemoglobina en sangre se mantienen constantes con la compensación de la eritropoyesis, la destrucción permanente de los glóbulos rojos envejecidos por macrófagos en la médula ósea, bazo e hígado. Cuantitativamente, aproximadamente 1 % de la masa de los glóbulos rojos, que es aproximadamente 2-3 x 1011 glóbulos rojos, se renueva cada día. Sin embargo, en situaciones que generan de forma eficaz hipoxia tisular, tal como pérdida de sangre o ubicación en altitudes elevadas, la inducción de EPO puede estimular la eritropoyesis 10 veces o más sobre los niveles normales.

Debido a que EPO estimula la producción de glóbulos rojos, es una terapia eficaz para muchas enfermedades y afecciones asociadas con un hematocrito reducido. Los ensayos iniciales de terapia de reemplazo con EPO recombinante humana para restablecer el hematocrito en pacientes con insuficiencia renal en etapa terminal se informaron por primera vez hace aproximadamente 20 años (véase p. ej., Winearls, CG; et al. (1986) Lancet, 2, 1175-1178, y Eschbach, J. W.; et al. (1987) N. Engl J. Med., 316, 73-78) . Este trabajo proporcionó un estímulo para estudios adicionales sobre la fisiopatología y la farmacología de EPO (véase p. ej., Jelkmann, W. y Gross, A. (1989) Er y thropoietin; Springer, Berlín Heidelberg Nueva York) .

A partir de esos primeros estudios, la EPO recombinante humana se ha usado satisfactoriamente para tratar numerosas afecciones patológicas. Por ejemplo, la aplicación farmacológica de EPO recombinante humana en pacientes quirúrgicos puede disminuir la gravedad y la duración de la anemia postoperatoria. La administración de EPO recombinante humana también ha demostrado que es una terapia eficaz para pacientes que padecen varias enfermedades no renales, tales como inflamación crónica, tumores malignos y SIDA, en donde una falta relativa de EPO endógena contribuye al desarrollo de anemia (véase p. ej., Means, R.T. y Krantz, S.B. (1992) Blood, 80, 16391647, y Jelkmann, W. (1998) J. Interf. Cytokine Res., 18, 555-559) . Además, se ha informado de que la EPO es protectora de tejidos en lesiones isquémicas, traumáticas, tóxicas e inflamatorias (véase p. ej., Brines M., et al. (2004) PNAS USA 101:14907-14912 y Brines, M. L., et al. (2000) . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 10526-10531) .

La utilidad y la eficacia de EPO para el tratamiento de anemias y otras afecciones que surgen de dicha gran diversidad de causas hace que la EPO recombinante humana quizá sea el fármaco más vendido en el mundo. De hecho, la cantidad de ventas estimadas es de más de 5 mil millones de dólares americanos al año.

Solamente una EPO recombinante humana, producida en la línea celular de Ovario de Hámster Chino (CHO) , se emplea ampliamente como un agente terapéutico. Dado que todos los mamíferos producen glicanos de estructura similar, Ovario de Hámster Chino (CHO) , Riñón de Cría de Hámster (BHK) , y Riñón Embrionario Humano 293 (HEK293) son las células huésped preferentes para la producción de agentes terapéuticos de glicoproteína. Tal como se conoce en la técnica, la glicosilación adecuada es un factor críticamente importante que influye en la vida media in vivo y en la inmunogenicidad de los péptidos terapéuticos. De hecho, las proteínas poco glicosiladas son reconocidas por el hígado como "viejas" y de este modo, se eliminan más rápidamente del organismo que las proteínas glicosiladas de forma adecuada.

Desafortunadamente, un aspecto frustrante y bien conocido de la glicosilación de proteínas es el fenómeno de la microheterogeneidad. Por lo tanto, incluso las células huésped preferentes para la producción de glicoproteínas terapéuticas humanas tales como EPO, producen por lo general péptidos que comprenden una gama de variaciones en estructura precisa del glicano. La extensión de esta heterogeneidad puede variar considerablemente desde el sitio de glicosilación al sitio de glicosilación, de proteína a proteína, y de tipo celular a tipo celular. Por lo tanto, numerosas glicoformas, cada una de las cuales es efectivamente una especie molecular distinta, por lo general existe en cualquier preparación dada de glicoproteínas.

El problema de la microheterogeneidad plantea por lo tanto numerosos problemas para la producción a gran escala industrial de glicoproteínas terapéuticas. En particular, dado que cada glicoforma puede representar a una especie molecular distinta, las preparaciones de glicoproteínas terapéuticas se deben fraccionar para purificar la glicoforma individual deseada. Complicaciones adicionales surgen del hecho de que diferentes lotes de producción pueden variar con respecto al porcentaje de la glicoforma deseada que comprende el lote de la glicoproteína terapéutica. Por lo tanto, porciones grandes, no siempre predecibles de cada preparación quizá se tengan que descartar, de modo que por último el rendimiento final de una glicoforma deseada puede ser bajo. En conjunto, el problema de la microheterogeneidad se refiere a que los glicopéptidos terapéuticos producidos por cultivos celulares de mamífero requieren costes de producción más elevados, que en último lugar se traduce en costes de salud que los que podrían ser necesarios si estuviera disponible un método más eficaz para preparar glicoproteínas terapéuticas más eficaces, de una duración más prolongada.

Una solución al problema de proporcionar glicopéptidos terapéuticos rentables ha sido proporcionar péptidos con vidas medias in vivo más largas. Por ejemplo, se han producido glicopéptidos terapéuticos con mejores propiedades farmacocinéticas mediante la unión de polímeros sintéticos a la cadena principal peptídica. Un polímero a modo de ejemplo que se ha conjugado con péptidos es el poli (etilenglicol) ("PEG") . Se ha demostrado el uso de PEG para derivatizar péptidos terapéuticos para reducir la inmunogenicidad de los péptidos. Por ejemplo, Pat. de EE.UU. Nº

4.179.337 (Davis et al.) desvela polipéptidos no inmunogénicos tales como enzimas y hormonas peptídicas acopladas a polietilenglicol (PEG) o a polipropilenglicol. Además de inmunogenicidad reducida, el tiempo de aclaramiento en circulación es prolongado debido al mayor tamaño del conjugado de PEG de los polipéptidos en cuestión.

El principal modo de unión de PEG, y sus derivados, a péptidos es una unión no específica a través de un resto de aminoácido del péptido (véase, p. ej., la patente de EE.UU. Nº 4.088.538, patente de EE.UU. Nº 4.496.689, patente de EE.UU. Nº 4.414.147, patente de EE.UU. Nº 4.055.635, y documento PCT WO 87/00056) . Otro modo de unión de PEG a péptidos es a través de la oxidación no específica de los restos de glicosilo en un glicopéptido (véase, p. ej., el documento WO 94/05332) .

En estos métodos no específicos, se añade poli (etilenglicol) de una manera no específica al azar a los restos reactivos en una cadena principal peptídica. Por supuesto, la adición aleatoria de moléculas de PEG tiene sus inconvenientes, que incluyen una falta de homogeneidad del producto final, y la posibilidad de reducción en la actividad biológica o enzimática del péptido. Por lo tanto, para la producción de péptidos terapéuticos, una estrategia de derivatización que da como resultado la formación de un producto básicamente homogéneo, fácilmente caracterizable y marcado específicamente es superior. Dichos métodos se han desarrollado.

Los agentes terapéuticos de péptidos homogéneos marcados se pueden producir in vitro a través de la acción de enzimas. A diferencia de los métodos habituales no específicos para la unión de un polímero sintético... [Seguir leyendo]

1. Un péptido de eritropoyetina que comprende el resto:

en donde D es un miembro seleccionado entre -OH y R1-L-HN-; G es un miembro seleccionado entre R1-L- y -C (O) alquilo (C1-C6) ; R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado entre:

en donde e, f y f ' son números enteros seleccionados independientemente de 1 a 2500; y q, q' y q" son números enteros seleccionados independientemente de 1 a 20; y L es un conector que es un miembro seleccionado entre un enlace, alquilo sustituido o sin sustituir y heteroalquilo sustituido o sin sustituir, de modo que cuando D es OH, G es R1-L-, y cuando G es -C (O) alquilo (C1-C6) , D es R1-L-NH-.

2. El péptido según la reivindicación 1, en donde L-R1 tiene la fórmula:

en donde a es un número entero de 0 a 20.

3. El péptido según cualquier reivindicación precedente, en donde dicho resto tiene la fórmula:

4. El péptido según la reivindicación 1 o 2, en donde dicho resto tiene la fórmula:

5. El péptido según la reivindicación 1 o 2, en donde dicho resto tiene la fórmula:

en donde AA es un resto de aminoácido de dicho péptido.

6. El péptido según la reivindicación 5, en donde dicho resto de aminoácido es serina o treonina.

7. El péptido según la reivindicación 6, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. Nº: 1.

8. El péptido según la reivindicación 7, en donde dicho resto de aminoácido es una serina en la posición 126 de la SEC. ID. Nº: 1.

9. El péptido según la reivindicación 1 o 2, en donde dicho péptido comprende al menos uno de dichos restos según una fórmula seleccionada entre:

en donde AA es un resto de aminoácido de dicho péptido y t es un número entero igual a 0 o 1.

10. El péptido según la reivindicación 9, en donde dicho resto de aminoácido es un resto de asparagina.

11. El péptido según la reivindicación 10, que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1, y en donde dicho resto de aminoácido es un resto de asparagina que es un miembro seleccionado entre N24, N38, N83, y combinaciones de los mismos.

12. El péptido según la reivindicación 1 o 2, que comprende al menos un resto de fórmula:

en donde AA es un resto de aminoácido de dicho péptido, y t es un número entero igual a 0 o 1.

13. El péptido según la reivindicación 12, en donde dicho resto de aminoácido es un resto de arginina.

14. El péptido según la reivindicación 13, que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1, y en donde dicho resto de aminoácido es un resto de asparagina que es un miembro seleccionado entre N24, N38, N83, y combinaciones de los mismos.

15. El péptido según la reivindicación 1, en donde dicho péptido comprende al menos uno de dichos restos según una fórmula seleccionada entre:

en donde AA es un resto de aminoácido de dicho péptido, y t es un número entero igual a 0 o 1.

16. El péptido según la reivindicación 1 en donde dicho péptido comprende al menos un resto mencionado según una fórmula seleccionada entre:

en donde AA es an resto de aminoácido de dicho péptido, y t es un número entero igual 0 o 1.

17. El péptido según la reivindicación 16, en donde dicho resto de aminoácido es un resto de asparagina.

18. El péptido según la reivindicación 17, en donde dicho péptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1, y en donde dicho resto de aminoácido es un resto de asparagina que es un miembro seleccionado entre N24, N38, N83, y combinaciones de los mismos.

19. El péptido según cualquier reivindicación precedente, en donde dicho péptido es un péptido de eritropoyetina bioactiva.

20. Un método para preparar una eritropoyetina PEG-ilada que comprende el resto:

en donde D es un miembro seleccionado entre -OH y R1-L-HN-; G es un miembro seleccionado entre R1-L- y -C (O) alquilo (C1-C6) ; R1 tiene una estructura que es un miembro seleccionado entre:

en donde e, f y f ' son números enteros seleccionados independientemente de 1 a 2500; y q, q' y q" son números enteros seleccionados independientemente de 1 a 20; y L es un conector que es un miembro seleccionado entre alquilo sustituido o sin sustituir y heteroalquilo sustituido o sin sustituir, de modo que cuando D es OH, G es R1-L-, y cuando G es -C (O) alquilo (C1-C6) , D es R1-L-NH-, comprendiendo dicho método:

(a) poner en contacto un sustrato peptídico de eritropoyetina que comprende el resto glicosilo:

con un resto dador de PEG-ácido siálico que tiene la fórmula:

y una enzima que transfiere dicho PEG-ácido siálico sobre el Gal de dicho resto glicosilo, en condiciones apropiadas para dicha transferencia.

21. El método de la reivindicación 20, que comprende adicionalmente, antes de la etapa (a) :

(b) expresar dicho sustrato peptídico de eritropoyetina en un huésped adecuado.

22. El método de la reivindicación 21, en donde dicho huésped se selecciona entre una célula de insecto y una 5 célula de mamífero.

23. El método de la reivindicación 22, en donde dicha célula de insecto es una línea celular de Spodoptera frugiperda.

24. El método de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, que comprende adicionalmente formular el péptido en una formulación farmacéutica.

25. Uso de un péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para la preparación de un medicamento para tratar una afección caracterizada por la producción comprometida de glóbulos rojos.

26. Uso de un péptido de de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para la preparación de un medicamento para potenciar la producción de glóbulos rojos en un mamífero.

27. Uso de un péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para la preparación de un medicamento para

tratar una lesión tisular caracterizada por daño resultante de isquemia, traumatismo, inflamación o contacto con sustancias tóxicas.

28. Una formulación farmacéutica que comprende un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

29. Un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para uso terapéutico. 20