Ensayo de anticuerpo antifármaco.

Método para la determinación inmunológica de un complejo inmunológico (complejo AF/AAF) de un anticuerpo de fármaco (AF) humano o humanizado y un anticuerpo contra dicho anticuerpo de fármaco (anticuerpo antifármaco,

AAF) en una muestra de una especie de mono seleccionada de entre Cynomolgus, Rhesus y babuino utilizando un ensayo de tipo sándwich, que comprende un anticuerpo de captura y un anticuerpo trazador, caracterizado porque uno de dichos anticuerpos es un anticuerpo de unión específica a IgG de Cynomolgus y que no se une a IgG humana y el otro anticuerpo es un anticuerpo de unión específica a inmunoglobulina humana y que no se une a IgG de Cynomolgus y porque la muestra se preincuba con una cantidad predeterminada de dicho anticuerpo de fármaco.

Ensayo de anticuerpo antifármaco La invención comprende un método para la determinación de anticuerpos antifármaco.

Antecedentes de la invención Los inmunoensayos de fase sólida estándares con anticuerpos monoclonales implican la formación de un complejo entre un anticuerpo adsorbido sobre una fase sólida (anticuerpo de captura) , un antígeno y un anticuerpo de otro epítopo del antígeno conjugado con un enzima o con un marcaje detectable (anticuerpo trazador) . De esta manera se forma un sándwich: fase sólida-anticuerpo de captura-antígeno-anticuerpo trazador. En el sándwich, la actividad del enzima conjugado a anticuerpo (o la cantidad de marcaje detectable) es proporcional a la concentración de antígeno en el medio de incubación. Un ensayo de tipo sándwich es el inmunoensayo de puente de doble antígeno, en el que los anticuerpos de captura y trazados se unen a diferentes epítopos del antígeno. Hoesel W. et al., J. Immunol. Methods 294:101-110, 294, informan de un ensayo de puente de doble antígeno anti-EPO en el que se utiliza una mezcla de rhEPO inmovilizado acoplado a grupos aminos y a grupos carbohidratos. Los inmunoensayos tales como el ELISA de puente de doble antígeno son tipos de ensayo comunes en la investigación de una respuesta inmunogénica de un paciente a un fármaco de anticuerpo. Mire-Sluis A.R. et al.., J. Immunol. Methods 289:1-16, 2004, resumen las recomendaciones para el diseño y optimización de los inmunoensayos utilizando la detección de anticuerpos del huésped contra productos biotecnológicos. Según Mire-Sluis et al., los bien conocidos formatos de ensayo de anticuerpo anti-fármaco presentan considerables desventajas. Los ensayos de anticuerpo antifármaco se mencionan, por ejemplo, en los documentos WO nº 2005/045058 y nº 90/006515. Los ensayos de anticuerpo antiidiotípico se mencionan, por ejemplo, en la patente US nº 5.219.730, documento WO nº 87/002778, y patentes EP nº 0 139 389 y nº 0 170 302. Wadhwa M. et al., J. Immunol. Methods 278:1-17, 2003, informan de estrategias para la detección, medición y caracterización de anticuerpos no deseados inducidos por productos biológicos terapéuticos. Un ensayo inmunológico para la determinación inmunológica de un anticuerpo contra un anticuerpo de fármaco en una muestra utilizando un inmunoensayo de puente de doble antígeno se describe en el documento PCT nº EP2007/001935. Un ensayo inmunológico para la determinación de anticuerpos humanos en monos se describe en el documento WO nº 2006/066912. En la técnica (por ejemplo documento US nº 2003/0068664) , también son conocidos sistemas de ensayo que permiten la detección de anticuerpos terapéuticos activos. Dichos sistemas requieren la unión del antígeno a una fase sólida, la unión del anticuerpo terapéutico a dicho antígeno unido y la detección del anticuerpo terapéutico unido mediante el antígeno a la fase sólida.

Bourdage J.S. et al. (J. Pharmaceut. Biomed. Anal. 39:685-690, 2005) informan del efecto del formato del inmunoensayo de puente de doble antígeno sobre la dependencia de la concentración de recubrimiento de antígeno y las implicaciones para el diseño de ensayos de inmunogenicidad para anticuerpos monoclonales.

Descripción resumida de la invención La invención proporciona un método para la determinación inmunológica de un complejo inmunológico (complejo DA/ADA) de un anticuerpo de fármaco (AF) humano o humanizado y un anticuerpo contra dicho anticuerpo de fármaco (anticuerpo antifármaco, AAF) en una muestra de una especie de mono seleccionada de entre Cynomolgus, Rhesus y babuino utilizando un ensayo de tipo sándwich, que comprende un anticuerpo de captura y un anticuerpo trazador, caracterizado porque uno de dichos anticuerpos es un anticuerpo de unión específica a IgG de Cynomolgus y que no se une a IgG humana y el otro anticuerpo es un anticuerpo de unión específica a inmunoglobulina humana y que no se une a IgG de Cynomolgus y porque la muestra se preincuba con una cantidad predeterminada de dicho anticuerpo de fármaco.

El complejo inmunológico se abrevia adicionalmente como complejo AF/AAF.

En una realización preferente de la invención, el anticuerpo de captura es un anticuerpo que se une específicamente a IgG humana y el anticuerpo trazador es un anticuerpo que se une específicamente a IgG de Cynomolgus y que no se una a inmunoglobulina humana. En una realización preferente de la invención, el anticuerpo de captura es un anticuerpo que se une específicamente a IgG de Cynomolgus y que no se une a inmunoglobulina humana y el anticuerpo trazador es un anticuerpo que se une específicamente a IgG humana.

El anticuerpo anti-Ig humana se une específicamente a IgG humana. Preferentemente, el anticuerpo anti-IgG de Cynomolgus y/o el anticuerpo anti-Ig humana es/son monoclonales. Dicho anticuerpo de unión específica a inmunoglobulina humana no se une a IgG de Cynomolgus. Preferentemente, dicho anticuerpo de unión a inmunoglobulina humana es producido por la línea celular DSM ACC2708. Dicho anticuerpo de unión a IgG de Cynomolgus no se une a IgG humana. Preferentemente dicho anticuerpo de unión a IgG de Cynomolgus es producido por la línea celular 3.25.12 (DSM nº ACC2799) , 3.29.15 (DSM nº ACC2800) , 4.38.30 (DSM nº ACC2801) ,

7.57.41 (DSM nº ACC2802) ó 7.72.32 (DSM nº ACC2803) .

Durante el curso de dicha determinación se forma un complejo entre el anticuerpo anti-IgG de Cynomolgus, el complejo AF/AAF y el anticuerpo anti-IgG humano y la cantidad de complejo formada se correlaciona con la concentración de complejo AF/AAF, AF y/o AAF.

Según la invención, se lleva a cabo un análisis de muestras tras la preincubación con una cantidad predeterminada del anticuerpo de fármaco. En dicho ensayo se observan señales positivas en el caso de que la muestra contenga anticuerpos antifármaco independientes de la presencia/ausencia de anticuerpos de fármaco en la muestra.

Preferentemente, el anticuerpo de captura se conjuga con la fase sólida mediante adsorción pasiva y, por lo tanto, se conjuga con la fase sólida en por lo menos dos sitios de anticuerpo diferentes. La adsorción pasiva se describe en, por ejemplo, Butler J.E., Solid Phases in Immunoassay, en: Immunoassays, Diamandis E.P. y Christopoulos T.K. (editores) , Academic Press San Diego, 1996, páginas 205-225.

En una realización preferente de la invención, el anticuerpo de captura se inmoviliza mediante una pareja de unión específica. Dicha pareja de unión (primer componente/segundo componente) es, por ejemplo, estreptavidina o avidina/biotina, anticuerpo/antígeno (ver, por ejemplo, Hermanson G.T. et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996) , lectina/polisacárido, esteroide/proteína de unión a esteroide, hormona/receptor de hormona, enzima/sustrato, IgG/proteína A y/o G, etc. Preferentemente, el anticuerpo de captura se conjuga con biotina y la inmovilización se lleva a cabo mediante avidina o estreptavidina inmovilizada.

Preferentemente, la conjugación del anticuerpo con su pareja de conjugación se lleva a cabo mediante unión química mediante grupos N-terminales y/o ε-amino (lisina) , grupos ε-amino de diferentes lisinas, grupos funcionales carboxi, sulfhidrilo, hidroxilo y/o fenólico del esqueleto de aminoácidos del anticuerpo y/o grupos de alcohol de sacárido de la estructura carbohidrato del anticuerpo.

En una realización preferente de la invención, el anticuerpo trazador se conjuga con un marcaje detectable, preferentemente se conjuga mediante una pareja de unión específica. Dicha pareja de unión (primer componente/segundo componente) es, por ejemplo, estreptavidina o avidina/biotina, anticuerpo/antígeno, lectina/polisacárido, esteroide/proteína de unión a esteroide, hormona/receptor de hormona, enzima/sustrato, IgG/proteína A y/o G, etc. Preferentemente, el anticuerpo trazador se conjuga mediante digoxigenina y un anticuerpo contra digoxigenina con el marcaje detectable. Alternativamente, el anticuerpo trazador se conjuga con un marcaje electroquimioluminiscente, tal como un complejo de rutenio-bispiridilo. En una realización preferente de la invención, el anticuerpo trazador se conjuga con digoxigenina y la unión al marcaje detectable se lleva a cabo mediante un anticuerpo contra la digoxigenina.

Descripción detallada de la invención La expresión "anticuerpo de fármaco" según la invención se refiere a un anticuerpo que puede administrarse en un individuo para el tratamiento de una enfermedad. En un ensayo llevado a cabo según la invención, el anticuerpo de fármaco y el anticuerpo de captura, o el anticuerpo de fármaco y el anticuerpo trazador, respectivamente comprenden "la misma" molécula de anticuerpo, por ejemplo producida recombinantemente... [Seguir leyendo]

1. Método para la determinación inmunológica de un complejo inmunológico (complejo AF/AAF) de un anticuerpo de fármaco (AF) humano o humanizado y un anticuerpo contra dicho anticuerpo de fármaco (anticuerpo antifármaco, AAF) en una muestra de una especie de mono seleccionada de entre Cynomolgus, Rhesus y babuino utilizando un ensayo de tipo sándwich, que comprende un anticuerpo de captura y un anticuerpo trazador, caracterizado porque uno de dichos anticuerpos es un anticuerpo de unión específica a IgG de Cynomolgus y que no se une a IgG humana y el otro anticuerpo es un anticuerpo de unión específica a inmunoglobulina humana y que no se une a IgG de Cynomolgus y porque la muestra se preincuba con una cantidad predeterminada de dicho anticuerpo de fármaco.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo de captura es un anticuerpo que se une específicamente a IgG humana y el anticuerpo trazador es un anticuerpo que se une específicamente a IgG de Cynomolgus y que no se une a inmunoglobulina humana.

3. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo de captura es un anticuerpo que se une específicamente a IgG de Cynomolgus y que no se une a inmunoglobulina humana y el anticuerpo trazador es un anticuerpo que se une específicamente a la IgG humana.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el anticuerpo de unión específica a IgG de Cynomolgus y/o el anticuerpo de unión específica a inmunoglobulina humana es/son monoclonales.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la cantidad de complejo formada se correlaciona con la concentración de complejo AF/AAF, de AF y/o de AAF.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el anticuerpo de captura se inmoviliza mediante una pareja de unión específica.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el anticuerpo trazador se conjuga con el marcaje detectable mediante una pareja de unión específica.

8. Método según la reivindicación 7, caracterizado porque el anticuerpo trazador se conjuga con digoxigenina y la unión al marcaje detectable se lleva a cabo mediante un anticuerpo contra la digoxigenina.