DISPOSITIVO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA HEPATITIS A.

Dispositivo para el diagnóstico de la Hepatitis A.

La presente invención pertenece al campo del diagnóstico de enfermedades causadas por virus.

En concreto, se refiere a un dispositivo inmunocromatográfico para el diagnóstico de la Hepatitis A mediante la detección del virus de la Hepatitis A o sus fragmentos en muestras de heces.

Dispositivo para el diagnóstico de la Hepatitis A

Campo de la invención La presente invención se encuadra dentro del área de la biotecnología y en concreto en el diagnóstico de enfermedades causadas por virus. El objeto de la invención es un dispositivo sencillo de detección del virus de la Hepatitis A o sus fragmentos en muestras de heces.

Antecedentes de la invención La Hepatitis A es un enfermedad del hígado causada por el Virus de la Hepatitis A (HAV) . Como otras hepatitis (B, C, D, E) un síntoma muy característico es la ictericia. Las infecciones por Hepatitis A son mucho más frecuentes en países muy poblados con bajos niveles higiénico-sanitarios. Afecta principalmente a niños de menos de 5 años de países en vías de desarrollo donde la seroprevalencia puede llegar al 100%.

El virus de la hepatitis A es transmitido entre las personas por la ruta oral-fecal. El virus se excreta abundantemente en las heces de las personas infectadas y es estable en el medioambiente durante largos períodos de tiempo. La adquisición típica es por ingestión de comida o agua contaminada con heces (Lemon SM. Type A viral hepatitis: epidemiology, diagnosis, and prevention. Clinical Chemistr y , 1997, 43 (8 (B) ) :1494-1499) .

El transcurso de la enfermedad es muy variable. Hay pacientes, especialmente niños, que no desarrollan síntomas, ni siquiera ictericia. La intensidad de los síntomas entre los pacientes que los manifiestan es también variable. El transcurso de la Hepatitis A (aguda) se puede dividir en 4 fases (Hepatitis A (WHO/CDS/CSR/EDC/2000.7) World Health Organization, 2000) :

- Incubación: Aproximadamente 30 días. No hay síntomas, pero si replicación activa del virus y gran transmisibilidad de la enfermedad.

- Preictericia: 4-10 días. Aparecen síntomas como: pérdida de apetito, fatiga, dolor abdominal, nauseas, vómitos, fiebre, diarrea, orina oscura y heces pálidas.

-Ictericia: Se presentan los síntomas de ictericia característicos de las hepatitis. Suelen remitir el resto de los síntomas. Desaparece la viremia pero las heces son infectivas una o dos semanas más desde la aparición de la de la ictericia.

- Convalescencia: El periodo de recuperación de la enfermedad es de duración variable 3-6 meses.

La expulsión de virus en las heces al igual que la viremia tiene lugar durante las fases de incubación y preictericia y cesa al alcanzar la fase de ictericia. Es precisamente entonces cuando empiezan a aparecer los anticuerpos en la sangre, primero los del tipo IgM y luego IgA e IgG (Stapleton JT and Lemon SM, Hepatitis A and Hepatitis E. In Infectious Diseases 5th ed. Philadelphia, Lippincott Co, 1994; 790-797) .

Actualmente el diagnóstico se realiza detectando la presencia de anticuerpos anti-HAV en el suero sanguíneo. De esta forma se distingue la hepatitis A de otras hepatitis. Más concretamente, el diagnóstico se basa en la identificación de anticuerpos tipo IgM anti-HAV en el suero de los pacientes durante la fase aguda de la enfermedad. Estos anticuerpos persisten en el suero entre 3 y 6 meses. Anticuerpos del tipo IgG anti-HAV también están presentes durante el transcurso de la enfermedad y persisten durante décadas después de una infección aguda (Hepatitis A (WHO/CDS/CSR/EDC/2000.7) World Health Organization, 2000) .

También se puede diagnosticar la enfermedad identificando dichos anticuerpos anti-HAV en muestras de saliva (WO 97/02490) .

El diagnóstico de la enfermedad en base a la medida de los anticuerpos anti-HAV en el suero (o saliva) presenta algunos inconvenientes:

-Requiere extracción de sangre y preparación del suero.

-Requiere hacerse por personal especializado en laboratorios convenientemente equipados.

-No indica si el paciente tiene una enfermedad activa, sólo que en algún momento el sistema inmunitario ha estado en contacto con el virus.

-Las personas vacunadas tienen anticuerpos y por lo tanto dan positivo en la prueba a pesar de no haber contraído la enfermedad.

-La aparición de anticuerpos anti-HAV tiene lugar aproximadamente 4 semanas después de la infección (18, 21-23, 40) por lo que hay un período ventana de 4 semanas en las que la enfermedad no es detectable por anticuerpos y el paciente además de estar incubando la enfermedad está excretando gran cantidad de virus en sus heces y puede ser el origen de un brote epidémico.

-Hay individuos portadores asintomáticos a los que no se les va a hacer la prueba de anticuerpos en el suero por no presentar síntomas pero que contribuyen a la propagación de la enfermedad.

Para solucionar todos estos problemas se ha desarrollado la presente invención consistente en un test rápido para detección de partículas virales o fragmentos del virus de la Hepatitis A en muestras fecales. Presenta las siguientes ventajas:

-No es necesaria la extracción de sangre y preparación del suero, basta con una muestra de deposiciones fecales.

-No se necesita equipamiento complejo de laboratorio ni personal especializado.

-Indica presencia de virus y por lo tanto enfermedad activa

-Se puede realizar en personas vacunadas.

-El período ventana se reduce de 4 semanas a solo unos días (ver figura 1) .

-El virus puede ser identificado en las heces de pacientes asintomáticos.

-Es rápido (10 minutos) y fácil de llevar a cabo.

La identificación de partículas virales o fragmentos del HAV se puede llevar a cabo mediante técnicas de ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) o reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . El “HAV-Antigen EIA” de Mediagnost (Reutlingen, Alemania) es un inmunoensayo tipo ELISA para la identificación de HAV en diversos tipos de muestra con cultivos celulares y heces. También se ha descrito la detección del HAV por identificación de secuencias de RNA mediante la utilización de una transcriptasa reversa (RT) y la PCR (Patente WO 2008145196) . Sin embargo este tipo de pruebas presenta algunos inconvenientes que han hecho que su utilización sea muy limitada:

-Tiempo: el ELISA requiere entre 2 y 3 horas y la PCR unas 8-10 horas.

-Ambos necesitan complejos equipos de laboratorio disponibles únicamente en laboratorios especializados y personal experto en las dichas técnicas.

-El ELISA presenta una limitada sensibilidad puesto que es necesario diluir mucho la muestra

-Presentan un elevado número de falsos positivos. En el caso del ELISA todo resultado positivo tiene que ser reevaluado después de haber sido incubado con una solución neutralizante asegurando el efecto bloqueante de la misma.

Objeto de la invención La presente invención se refiere en un aspecto a un dispositivo inmunocromatográfico para el diagnóstico de la hepatitis A en forma de tira con un sitio de aplicación de la muestra, una membrana porosa en la que se visualiza el resultado y un absorbente caracterizado porque:

a. se han inmovilizado anticuerpos específicos contra el virus de la Hepatitis A en la línea de test de la membrana porosa,

b. se ha impregnado un conjugado preparado con anticuerpos contra el virus de la Hepatitis A y una partícula marcadora corriente abajo del lugar de aplicación de la muestra

c. se han utilizado materiales cuyas características y tamaño de poro permiten el flujo de la materia particulada de las heces.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Esquema de las etapas del método de diagnóstico. El dispositivo o vial específico para la toma de muestras fecales (Figura 1A) es un vial de plástico de unos 3-4 mL de capacidad, en el que previamente se ha dispensado 1 ml de diluyente para la dispersión, con un tapón a rosca que dispone de un vástago cuyo extremo, diseñado al efecto, permite la recolección de una porción de heces (Figura 1B) sólidas o semisolidas y su introducción en el vial. Tras esto, se cierra y se agita vigorosamente (Figura 1C) hasta la completa dispersión de la muestra. Por último, se rompe la parte superior del dispositivo (Figura 1D) y se añaden unas gotas sobre el lugar de aplicación de la muestra del dispositivo inmunocromatográfico (Figura 1E) .

Figura 2: Vistas del dispositivo inmunocromatográfico. Figura 2A: Vista superior del dispositivo inmunocromatográfico en formato tira. Dicha tira incluye los siguientes elementos: un material absorbente (1) , membrana porosa (2) con una línea de test (3) y otra de control (4) , un lugar de aplicación de la muestra (5) y un lugar para el conjugado anticuerpo-marcador (6) . Figura 2B: Vista de la sección del dispositivo inmunocromatográfico en formato tira en la que se distinguen además de los elementos descritos en la Figura 2A, el soporte... [Seguir leyendo]

1. Dispositivo inmunocromatográfico para el diagnóstico de la hepatitis A en forma de tira con un sitio de aplicación de la muestra, una membrana porosa en la que se visualiza el resultado y un absorbente caracterizado porque:

a. se han inmovilizado anticuerpos específicos contra el virus de la Hepatitis A en la línea de test de la membrana porosa,

b. se ha impregnado un conjugado preparado con anticuerpos contra el virus de la Hepatitis A y una partícula marcadora corriente abajo del lugar de aplicación de la muestra c. se han utilizado materiales cuyas características y tamaño de poro permiten el flujo de la 10 materia particulada de las heces.

2. Dispositivo inmunocromatográfico de acuerdo con la reivindicación anterior, dispuesto en el interior de una carcasa de plástico que lo protege.

3. Kit de diagnóstico de la Hepatitis A que comprende el dispositivo inmunocromatográfico de la reivindicación 2 y un diluyente para dispersión de la muestra fecal.

4. Kit según la reivindicación anterior, donde el diluyente para dispersión de la muestra fecal va en un vial específico para la toma de muestras fecales.