Dispositivo para la detección de Shigella dysenteriae serotipo 1.

Dispositivo para la detección de Shigella dysenteriae serotipo 1.

La presente invención se refiere a un dispositivo inmunocromatográfico para la detección simultánea y diferenciada de Shigella dysenteriae serotipo 1 y de la toxina Shiga. Asimismo, se refiere a un procedimiento para la detección de Shigella dysenteriae serotipo 1 mediante la utilización de dicho dispositivo inmunocromatográfico y a un kit que comprende dicho dispositivo inmunocromatográfico.

Dispositivo para la detección de Shigella dysenteriae serotipo 1 Campo de la invención

La presente invención pertenece al campo de la detección de Shigella dysenteriae. En concreto, se refiere a un dispositivo inmunocromatográfico para la detección de Shigella dysenteriae serotipo 1 de una manera rápida, sencilla y fiable

Antecedentes de la invención

El género Shigella está constituido por bacilos Gram-negativos inmóviles, no capsulados que no fermentan la lactosa y son termentadores de la glucosa con producción de ácido pero no de gas. Este género posee cuatro especies: Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii y Shigella sonnei y cada especie, con la excepción de S. sonnei, tiene varios serotipos. En general, S. sonnei es más común en los países desarrollados y S. flexneri y S. dysenteriae serotipo 1, en países en desarrollo. El sello distintivo de la infección por Shigella es la diarrea con sangre, frecuentemente conocida como "disentería".

Los únicos huéspedes naturales de Shigella son el humano y algunas especies de primates. Son altamente transmisibles con una dosis infecciosa muy baja, del orden de 10 a 100 microorganismos. La transmisión tiene lugar a través de alimentos contaminados con heces, por las manos, fómites o incluso por las moscas.

La disentería epidémica en países en desarrollo es causada frecuentemente por S. dysenteriae serotipo 1, también llamada Shiga bacillus. Shigella dysenteriae serotipo 1 (referida de aquí en adelante como S. dysenteriae 1 o SD1) difiere de otros serotipos de S. dysenteriae y de otras cepas de Shigella por varias razones:

Solo S. dysenteriae 1 expresa la toxina Shiga Stx (STX).

Solo S. dysenteriae 1 causa epidemias de disentería grandes y prolongadas.

La infección con S. dysenteriae 1 causa enfermedad más grave, más prolongada y con mayor letalidad que las infecciones producidas por otros grupos de Shigella.

La resistencia a los antimicrobianos se desarrolla más rápidamente y ocurre con

mayor frecuencia cuando se trata de cepas de S. dysenteriae 1 que con otros grupos.

La identificación tradicional de Shigella spp se basa en su aislamiento en medios de cultivo. Para un aislamiento óptimo de este microorganismo, deben utilizarse dos medios selectivos diferentes: uno de siembra para propósitos generales de baja selectividad, como el AMC (Agar MacConkey), y otro de agar más selectivo, como es el agar DXL (Agar desoxicolato xilosa lisina). Una vez seleccionadas las colonias sospechosas de las placas de AMC y agar DXL se inoculan en medios de pesquisaje apropiados, tales como agar hierro de Kligler (AHK) o agar hierro triple azúcar (AHTA).

Recientemente se han desarrollado distintos métodos de identificación molecular basados, por ejemplo, en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en enzimoinmunoensayos, en epifluorescencia, etc.. Sin embargo, estos métodos son caros, necesitan de personal especializado y equipamiento sofisticado. Además, por ejemplo en el caso de los métodos basados en PCR, la mayoría se basan en la amplificación de la secuencia del gen del antígeno H del plásmido de invasión (ipaH), expresado por las cuatro especies de Shigella (CN 102424839 A, resumen). Sin embargo, dicho gen también lo expresan otros organismos, como E. coli enteroinvasiva (EIEC), lo que resulta en falsos positivos.

Existen también en el mercado kits para la identificación serológica de Shigella (Shigella slide agglutiantion antisera® de Pro-lab diagnostics, por ejemplo). La identificación serológica se lleva a cabo mediante el cultivo y la posterior mezcla de las colonias sospechosas de ser Shigella con un antisuero que contiene anticuerpos específicos contra Shigella. Las bacterias Shigella se aglutinan (aglomeran) en presencia de antisuero homólogo. Este método, sin embargo, debe ser realizado por personal cualificado.

No se ha descrito hasta el momento ningún ensayo inmunocromatográfico para la detección de Shigella que pueda ser llevado a cabo sin necesidad de equipación especial y de una manera rápida y sencilla. En este sentido, los autores de la presente invención, han desarrollado un dispositivo inmunocromatográfico para la detección de S. dysenteriae serotipo 1 mediante la preparación de una única muestra y que puede llevarse a cabo sin necesidad de un cultivo previo. Sorprendentemente, dicho dispositivo permite identificar el serotipo 1 de S. dysenteriae y diferenciar Shigella dysenteriae serotipo 1 y E.coli evitando falsos positivos. La presente invención, proporciona así un método de detección de S.

dysenteriae serotipo 1, basado en la utilización de dicho dispositivo inmunocromatográfico, rápido, sencillo y de fácil interpretación.

Objeto de la invención

Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un dispositivo inmunocromatográfico de flujo lateral para detectar Shigella dysenteriae serotipo 1 (dispositivo de la invención) caracterizado por que comprende:

i) dos tiras inmunocromatográficas,

donde una tira (8') comprende en el sentido del flujo:

- un primer material absorbente que comprende una zona de aplicación de la muestra (1) y una zona con micropartículas conjugadas con un primer anticuerpo anti-S. dysenteriae 1 (2') depositadas sobre dicho primer material absorbente,

- una membrana porosa (3) con un segundo anticuerpo anti-S. dysenteriae 1 (4') inmovilizado, y

- un segundo material absorbente (6), y donde otra tira (8'') comprende en el sentido del flujo:

- un primer material absorbente que comprende una zona de aplicación de la muestra (1) y una zona con micropartículas conjugadas con un primer anticuerpo anti-STX (2'') depositadas sobre dicho primer material absorbente,

- una membrana porosa (3) con un segundo anticuerpo anti-STX (4'') inmovilizado, y

- un segundo material absorbente (6), o

ii) una tira inmunocromatográfica (8''') que comprende en el sentido del flujo:

- un primer material absorbente que comprende una zona de aplicación de la muestra (1) y una zona con una mezcla de micropartículas conjugadas con un primer anticuerpo anti-S. dysenteriae 1 y micropartículas conjugadas con un primer anticuerpo anti- STX (2''') depositada sobre dicho primer material absorbente,

- una membrana porosa (3) con un segundo anticuerpo anti-S. dysenteriae 1 y un segundo anticuerpo anti-STX inmovilizados por separado (4'''), y

- un segundo material absorbente (6).

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para detectar S. dysenteriae 1 (procedimiento de la invención) caracterizado por que comprende las

siguientes etapas:

a) tomar una muestra,

b) dispersar la muestra tomada en la etapa a) en un diluyente,

c) aplicar la dispersión obtenida en la etapa b) en la zona de aplicación de la muestra (1) del dispositivo de la invención, y

d) esperar a la aparición de inmunocomplejos en la membrana porosa (3).

Un tercer aspecto de la presente invención se refiere al uso del dispositivo de la invención para la detección de S. dysenteriae 1.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un kit para la detección de S. dysenteriae 1 que comprende el dispositivo de la invención.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Vistas del dispositivo de la invención. A: Vista en perspectiva de una tira inmunocromatográfica (8), que comprende, en el sentido del flujo, los siguientes elementos: un lugar de aplicación de la muestra (1), un lugar en el que se han depositado micropartículas conjugadas con un anticuerpo específico para el marcador de interés a detectar (2), una membrana porosa (3) con una línea de test para la detección del marcador de interés (4) y con una línea control (5), y un material absorbente (6), y está situada sobre un soporte plástico (7). B: Vista en planta superior del dispositivo para la detección de S. dysenteriae 1 con dos tiras inmunocromatográficas (8', 8"). C: Vista en planta superior del dispositivo de la Fig. 1B introducido en una carcasa (11) que tiene una ventana de aplicación de la muestra (9) y una ventana de resultados (10) para cada tira inmunocromatográfica.

Figura 2: A: Vista en perspectiva de una tira inmunocromatográfica (8"'), que comprende, en el sentido del flujo, los siguientes elementos: un lugar de aplicación de la muestra (1), un lugar en el que se ha depositado una mezcla de micropartículas conjugadas con un anticuerpo anti-S. dysenteriae 1 y de micropartículas conjugadas con un primer anticuerpo anti-STX (2"'), una membrana porosa (3) con dos líneas de test (4"'), una para la detección de S. dysenteriae 1 y otra para la detección de STX... [Seguir leyendo]

1.- Dispositivo inmunocromatográfico de flujo lateral para detectar Shigella dysenteriae serotipo 1 caracterizado por que comprende:

i) dos tiras inmunocromatográficas,

donde una tira (8') comprende en el sentido del flujo:

- un primer material absorbente que comprende una zona de aplicación de la muestra (1) y una zona con micropartículas conjugadas con un primer anticuerpo anti-S. dysenteriae serotipo 1 (2') depositadas sobre dicho primer material absorbente,

- una membrana porosa (3) con un segundo anticuerpo anti-S. dysenteriae serotipo 1 (4') inmovilizado, y

- un segundo material absorbente (6), y donde otra tira (8'') comprende en el sentido del flujo:

- un primer material absorbente que comprende una zona de aplicación de la muestra (1) y una zona con micropartículas conjugadas con un primer anticuerpo anti-STX (2'') depositadas sobre dicho primer material absorbente,

- una membrana porosa (3) con un segundo anticuerpo anti-STX (4'') inmovilizado, y

- un segundo material absorbente (6), o

ii) una tira inmunocromatográfica (8''') que comprende en el sentido del flujo:

- un primer material absorbente que comprende una zona de aplicación de la muestra (1) y una zona con una mezcla de micropartículas conjugadas con un primer anticuerpo anti-S. dysenteriae serotipo 1 y micropartículas conjugadas con un primer anticuerpo anti- STX (2''') depositada sobre dicho primer material absorbente,

- una membrana porosa (3) con un segundo anticuerpo anti-S. dysenteriae serotipo 1 y un segundo anticuerpo anti-STX inmovilizados por separado (4'''), y

- un segundo material absorbente (6).

2.- Procedimiento para la detección de S. dysenteriae serotipo 1 caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a) tomar una muestra,

b) dispersar la muestra tomada en la etapa a) en un diluyente,

c) aplicar la dispersión obtenida en la etapa b) en la zona de aplicación de la muestra (1) de un dispositivo inmunocromatográfico según la reivindicación 1,

d) esperar a la aparición de inmunocomplejos en la membrana porosa (3).

3.- Procedimiento según la reivindicación anterior, donde la muestra se selecciona del grupo formado por alimentos, agua y muestra biológica.

4.- Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3, donde la muestra biológica se selecciona del grupo formado por heces y coprocultivos.

5.- Procedimiento según la reivindicación 2, donde la muestra es heces.

6.- Uso de un dispositivo según la reivindicación 1 para la detección de S. dysenteriae serotipo 1.

7.- Kit para la detección de S. dysenteriae serotipo 1 que comprende un dispositivo según la 15 reivindicación 1.

8.- Kit según la reivindicación anterior, donde el dispositivo está introducido en una carcasa con dos ventanas para cada tira inmunocromatográfica, siendo una ventana para la aplicación de la muestra (9) y otra ventana para la visualización de los resultados (10).