Dispositivo inmunocromatográfico para el diagnóstico rápido de enfermedades causadas por Clostridium difficile que,

mediante la aplicación de la muestra de heces dispersada en un diluyente, permite la detección simultánea y diferenciada de glutamato deshidrogenasa de Clostridium difficile y de lactoferrina y/o calprotectina fecales mediante la formación de conjugados con partículas coloreadas y su captura en una membrana porosa.

Dispositivo para el diagnóstico rápido de enfermedades causadas por Clostridium difficile en muestras fecales Campo de la invención La presente invención se encuadra dentro del área de la biotecnología y en concreto en el diagnóstico de enfermedades gastrointestinales causadas por Clostridium difficile. El objeto de la invención es un dispositivo que permite un diagnóstico sencillo de las enfermedades causadas por Clostridium difficile (CD) mediante la detección de la glutamato deshidrogenasa (GDH) de Clostridium difficile y lactoferrina humana (hLf) y/o calprotectina humana (hCp) .

Estado de la técnica

Clostridium difficile es un bacilo anaerobio grampositivo que forma esporas que le permiten sobrevivir en condiciones adversas (sequedad, calor, salinidad, …) . Clostridium difficile es uno de los patógenos entéricos más frecuentemente identificado en pacientes hospitalizados.

La infección por Clostridium difficile es la principal causa de diarrea, colitis y colitis pseudomembranosa asociada a la toma de antibióticos. Existen cepas que producen toxinas (A y/o B) y otras que no las producen. Solo las cepas toxigénicas causan diarrea.

Las formas de diagnosticar una infección causada por Clostridium difficile son:

A. Cultivo y aislamiento a partir de muestras de heces. Se hace en condiciones anaerobias y es muy lento y costoso. No tiene mucha sensibilidad, pero permite hacer test de susceptibilidad a antibióticos de cara a un posible tratamiento.

B. Citotoxicidad en cultivo celular. Este método es considerado método de referencia. Presenta una especificidad y sensibilidad cercanas al 100 %. Sin embargo, es una técnica lenta (más de dos días) , costosa (cultivo celular) y requiere personal muy especializado.

C. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Método específico y sensible que además permite distinguir distintas variantes. Es caro, necesita de personal especializado y equipamiento sofisticado.

D. Enzimoinmunoensayos (ELISA) . Detectan la presencia de las Toxinas A y B juntas o por separado. Es más fácil y rápida (2h) que la citotoxidad en cultivo celular y la PCR pero tiene una baja sensibilidad (45-95 %) debido a que a menudo la concentración de las toxinas en las heces es extremadamente baja. Para superar el problema de la baja sensibilidad que presentan los inmunoenesayos de detección de toxinas se ha propuesto su utilización combinada con la detección de la glutamato deshidrogensa de Clostridium difficile (GDH) , que presenta una buena sensibilidad y especificidad aunque no es capaz de distinguir entre cepas patógenas (toxigénicas) y no patógenas (no toxigénicas) (EP 1019724) . Pero este procedimiento adolece de baja sensibilidad para las cepas patógenas (productoras de toxinas) .

E. Inmunocromatografía. Los test inmunocromatogáficos (IC) son rápidos, baratos y fáciles de llevar a cabo. Existen en el mercado varios tipos de test: los que detectan los toxinas como el C. diff QUICK CHECK (Techlab, Inc., Blacksburg, VA USA) y que adolecen de la misma falta de sensibilidad que el ELISA por la, a menudo, extremadamente baja concentración fecal de de Toxinas A y/o B; y los que detectan la glutamato deshidrogensa de Clostridium difficile (GDH) como el ImmunoCard® C. difficile GDH Test (Meridian Bioscience, Cincinnati, OH, USA) . Estos test son muy sensibles y específicos pero son incapaces de distinguir entre cepas patógenas (toxigénicas) y no patógenas (no toxigénicas) .

Para superar el problema de la baja sensibilidad que presentan los inmunoensayos de detección de toxinas algunos autores (Wren, MW et al. en Br J Biomed Sci. 2009; 66 (1) ; 1-5.) han propuesto la determinación de la lactoferrina fecal como ayuda al diagnóstico de de las enfermedades causadas por Clostridium difficile.

La lactoferrina (hLf) fecal es un marcador de presencia de leucocitos normalmente asociados a procesos inflamatorios. En la patente europea EP0641441 se describe una prueba in vitro para la determinación de leucocitos en muestras de heces utilizando un inmunoensayo con anticuerpos anti-lactoferrina.

Al igual que la lactoferrina, la calprotectina (hCp) es marcador inflamatorio. Se libera por los leucocitos activados por procesos inflamatorios o infecciosos. La patente US5455160 describe un método inmunológico para la detección de calprotectina humana fecal y su uso para el despistaje de algunas enfermedades intestinales como la enfermedad inflamatoria intestinal y el cáncer colorrectal.

El documento de patente WO2012052586 (A1) describe un inmunoensayo rápido para detección simultánea y diferenciada de calprotectina y lactoferrina humanas fecales y aplicación en el diagnóstico de algunas enfermedades intestinales en las que intervienen procesos inflamatorios como la enfermedad inflamatoria intestinal y el cáncer colorrectal.

En todo lo descrito anteriormente, los inmunoensayos para GDH y calprotectina y/o lactoferrina son distintos y usualmente basados en técnicas diferentes. Se realiza un determinado inmunoensayo para GDH y otro para calprotectina y/o lactoferrina, lo que significa que hay que preparar muestras distintas, en diluyentes distintos, y realizar ensayos distintos y esto implica:

provienen de dos muestras o técnicas diferentes.

El objeto de la presente invención es un dispositivo de diagnóstico rápido del tipo inmunocromatogáfico (IC) para la determinación simultánea y diferenciada de GDH, calprotectina y/o lactoferrina en muestras fecales que presenta las siguientes ventajas:

a. Se ensayan simultáneamente con lo que se reduce el tiempo de ensayo y el número de manipulaciones, reduciéndose así el riesgo de error. La determinación simultánea de los marcadores hace que la prueba sea más sensible.

b. La determinación es diferenciada, es decir, se visualiza en líneas distintas la presencia de calprotectina, lactoferrina y GDH. La determinación diferenciada de los marcadores hace que la prueba pueda ser más específica.

c. Se utilizan unos viales específicos que permite la toma de la muestra de forma cuantitativa y su dispersión en el diluyente de manera fácil e higiénica.

Descripción breve El método de diagnóstico de la presente invención consiste en: la toma de una porción representativa de la muestra de heces, su dispersión en un diluyente específico, la aplicación de esta dispersión de la muestra en un dispositivo inmunocromatográfico específico, la formación de complejos entre los anticuerpos del dispositivo y los antígenos de la muestra y la visualización de estos complejos en la membrana del dispositivo.

El dispositivo inmunocromatográfico utilizado es de un solo uso. No se requiere ningún tipo de instrumentación para llevar a cabo el método o interpretar el resultado. Como muestra se utilizan heces.

El tiempo de preparación de la muestra son unos dos minutos y el tiempo de desarrollo de la prueba es de 5 a 10 minutos, lo que significa entre 10 y 20 veces menos que los ensayos ELISA o PCR, mucho más complejos de llevar a cabo y que necesitan de instrumentación de laboratorio.

Por su sencillez la prueba se puede llevar a cabo en la consulta del médico, e incluso, con las instrucciones adecuadas, por el propio paciente.

Descripción de la figuras Figura 1: Esquema de las etapas del método de diagnóstico. El dispositivo o vial específico para la toma de muestras fecales de forma cuantitativa (Figura 1A) es un vial de plástico de unos 2-3 mL de capacidad, en el que previamente se ha dispensado 1 mL de diluyente, con un tapón a rosca que dispone de un vástago cuyo extremo, diseñado al efecto, permite la recolección cuantitativa de una muestra de heces (Figura 1B) sólidas o semisólidas cuando al pasar por el anillo reductor (8) son introducidas en el vial. Tras esto, se cierra y se agita vigorosamente (Figura 1C) hasta la completa dispersión de la muestra. Por último, se rompe la parte opuesta del dispositivo (Figura 1D) y se añaden unas gotas sobre el lugar de aplicación de la muestra del dispositivo inmunocromatográfico (Figura 1E) . En caso de que no se requiera la toma de muestras de forma cuantitativa se utiliza un vial de características similares pero sin anillo reductor (8) .

Figura 2: Vistas del dispositivo de diagnóstico.

Figura 2A: Vista...

1. Dispositivo inmunocromatográfico para el diagnóstico de las enfermedades causadas por Clostridium difficile en muestras de heces caracterizado por que comprende:

a. Una tira inmunocromatográfica para detección de glutamato deshidrogenasa de Clostridium difficile.

b. Una tira inmunocromatográfica para detección diferenciada de lactoferrina y calprotectina.

2. Dispositivo según la reivindicación 1 en el que, además de glutamato deshidrogenasa, se detecta sólo lactoferrina.

3. Dispositivo según la reivindicación 1 en el que, además de glutamato deshidrogenasa, se detecta sólo calprotectina.

4. Método de diagnóstico de las enfermedades causadas por Clostridium difficile caracterizado por que comprende:

a. La obtención de una muestra de heces,

b. La dispersión del material fecal de la muestra en tampón o diluyente,

c. La aplicación de esta dispersión en las ventanas de muestra del dispositivo de las reivindicaciones 1-3,

d. La interpretación del resultado según la aparición de líneas coloreadas en las ventanas de resultados.

5. Método de diagnóstico de las enfermedades causadas por Clostridium difficile según la reivindicación 4 caracterizado por que comprende:

a. La dispersión del material fecal de la muestra en un vial que permite la detección de glutamato deshidrogenasa de Clostridium difficile a la máxima sensibilidad,

b. La dispersión del material fecal de la muestra en un vial para la toma de muestra de forma cuantitativa para la detección de lactoferrina y/o calprotectina con un umbral de detección definido.

6. Kit para llevar a cabo diagnóstico de las enfermedades causadas por Clostridium difficile caracterizado porque comprende:

a. Un dispositivo inmunocromatográfico según las reivindicaciones 1-3,

b. Uno o varios diluyentes adecuados para suspensión y dispersión del material fecal,

c. dos viales para la toma de muestra y su manipulación.