MÉTODO Y DISPOSITIVO PARA EL DIAGNÓSTICO RÁPIDO DE ENFERMEDADES EN MUESTRAS FECALES.
Método de diagnóstico rápido y dispositivo para llevarlo a cabo que,
mediante la aplicación de una muestra de heces dispersada en un diluyente, permite la detección simultánea y diferenciada de lactoferrina y calprotectina fecales mediante la formación de conjugados con partículas coloreadas y su captura en una membrana porosa.
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201031537.
Solicitante: CERTEST BIOTEC, S.L..
Nacionalidad solicitante: España.
Inventor/es: LANDETA ELORZ,OSCAR, GENZOR ASIN,CARLOS GUSTAVO, VELASCO MICHELENA,Beatriz.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- G01N33/53 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.
Fragmento de la descripción:
Campo de la invención
La presente invención se encuadra dentro del área de la biotecnología y en concreto en el diagnóstico de enfermedades gastrointestinales. El objeto de la invención es un procedimiento
rápido y sencillo de detección de lactoferrina (hLf) y calprotectina (hCp) fecales como marcadores para el diagnóstico de la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) , la diarrea infecciosa (ID) y el cáncer colorrectal (CRe) .
Estado de la técnica
Enfermedad inflamatoria intestinal
Enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) es un término amplio para describir ciertas enfermedades que se caracterizan por una inflamación idiopática y crónica del tracto digestivo. La enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) incluye la enfermedad de Crohn (CD) , colitis ulcerosa (Ue) y un tipo no específico o indeterminado de colitis (le) .
En muchas ocasiones y debido a que presentan mucha similitud en sus síntomas, la IBD es
muy difícil de distinguir del síndrome del intestino irritable (lBS) . Éste último es una enfermedad benigna, en contraposición a la IBD pero cuyos síntomas son muy semejantes a las de la IBD.
Los procesos inflamatorios como la IBD suelen estar asociados a la presencia de leucocitos. Para un diagnóstico fiable se ha identificado diversos posibles marcadores de la enfermedad.
En la patente europea EP0641441 se describe una prueba in vitro para la determinación de leucocitos en muestras de heces utilizando un inmunoensayo con anticuerpos antilactoferrina. En la patente US7192724 ya se describe un método para diferenciar IBD de lBS midiendo la concentración de lactoferrina en heces utilizando un inmunoensayo tipo ELlSA. Incluso se ha establecido que esa concentración puede ser útil para monitorizar el desarrollo
de la enfermedad (Patente US7560240) .
Por otra parte, la patente US5455160 revela un método inmunológico para el despistaje de la IBD y CRC usando un ensayo ELlSA para determinar calprotectina en muestras de heces.
Se han descrito otros posibles marcadores para el diagnostico de la IBD entre los que
destacan ANCA y ANSA aunque los mejores resultados se obtienen con lactoferrina y calprotectina fecales (Turkay, C. et Kasapoglu, B. CLlNICS 2010; 65 (2) :221-31) . Vieria, A. et al. (BMC Research Notes 2009, 2:221) indica que tanto la medida de la lactoferrina como de la calprotectina fecales por ELlSA son marcadores altamente sensibles y específicos de la IBD y correlacionan con el grado de inflamación. Por último Gisbert, J. et al. (Inflamm Bowel Dis 2009; 15:1190-1198) determina que la medida por separado de ambos marcadores es útil en la predicción de una recaída en pacientes con CD o Uc.
Acompañando a estas patentes y resultados experimentales existen en el mercado tanto pruebas ELlSA como test inmunocromatograficos (le) para la determinación por separado de lactoferina y calprotectina. El LEUKO EZ VUE™ de Techlab (Blacksburg, VA) es un test inmunocromatografico (le) para la detección cualitativa de niveles elevados de lactoferrina en muestras de heces. El Prevent ID Caldetect de Preventis (Bensheim, Alemania) es un test IC semicuantitativo para la detección de calprotectina en heces para la diferenciación de IBD de lBS, al igual que el Quantum Blue Calprotectin Rapid Test de Bühlmann (Basilea, Suiza) .
En todo lo descrito hasta ahora los inmunoensayos para calprotectina y lactoferrina son distintos, es decir, se hace por un lado un inmunoensayo para calprotectina y otro para lactoferrina, lo que significa que hay que preparar muestras distintas, en diluyentes distintos, y realizar ensayos distintos y esto implica:
a. Un mayor gasto de tiempo.
b. Un mayor número de manipulaciones con el inherente riesgo de error.
c. Los resultados obtenidos para los dos parámetros no se correlacionan directamente puesto que provienen de dos tomas de muestra diferentes.
El objeto de la presente invención es un test rápido del tipo IC para la determinación simultánea y diferenciada de calprotectina y lactoferrina en muestras fecales que presenta las siguientes ventajas:
a. Se prepara una única muestra. Cuando ambas proteínas se analizan por separado hay dos muestras diferentes en diluyentes diferentes.
b. Se ensayan simultáneamente con lo que se reduce el tiempo de ensayo y el El dispositivo de la presente invención permite la detección simultánea y diferenciada de
número de manipulaciones, reduciéndose así el riesgo de error. simultánea de dos marcadores hace que la prueba sea más sensible. La determinación s c. La determinación es diferenciada, es decir, se visualiza en una línea la presencia de lactoferrina y en otra línea distinta la presencia de calprotectina. La determinación diferenciada de dos marcadores hace que la prueba pueda ser más específica. d. Se utiliza un vial específico que permite la toma de la muestra cuantitativa y su dispersión en el diluyente de manera fácil e higiénica. de forma 10 Diarrea infecciosa (ID) lS Otro de los casos de aplicación de la presente invención es la gestión de la diarrea aguda. Aunque el origen de la diarrea puede ser muy diverso, es importante discernir si se trata de un proceso no invasivo (autolimitado, no inflamatorio) de un proceso invasivo (agresivo, inflamatorio) . El tratamiento del primero se limita a una terapia de rehidratación y reposición de electrolitos mientras que el segundo requiere tratamiento especifico usualmente con agentes antimicrobianos. 20 Las diarreas con procesos inflamatorios suelen estar causadas por Salmonella, Shigella, Campylobacter jejuni o Clostridium difficile. El diagnóstico de estas se hace por cultivo de las heces e identificación de los patógenos. El cultivo es una técnica larga y costosa. ehoi, S. W. et al. (Journal of elinical Microbiology, 1996:928-932) proponen el uso de un látex de aglutinación para detectar la presencia de lactoferrina en muestras de heces como método de despistaje para evitar el cultivo en caso de diarreas agudas. 2S Shastri, Y.M., et al. (Am .1 Med. 2008, 121 (12) :1099-106) describen que la determinación de calprotectina fecal muestra una alta correlación con infecciones bacterianas que producen diarrea y propone su determinación como método de despistaje rápido de la diarrea infecciosa antes de proceder al cultivo. 30 En la patente US6727073 se describe un test le para el diagnostico de la diarrea infecciosa que detecta simultáneamente lactoferrina y uno o varios antígenos de las bacterias que pueden causarla, a saber, Salmonella, E. colí 0157, Listeria, Yersinia, Shigella, Campylobacter jejuni o Clostridium difficile.lactoferrina y calprotectina fecales y constituye una herramienta en el diagnóstico y el manejo de los casos de diarrea aguda.
Cáncer colorrectal (CRe) .
El cáncer colorrectal es una enfermedad en la que las células malignas se localizan en la porción intermedia y más larga del intestino grueso. Una de las herramientas diagnosticas más utilizadas para el despistaje del CRC es le detección de sangre oculta en heces (FOB) . La forma más sensible y específica es un inmunoensayo para la detección de la hemoglobina ya sea en forma de ELlSA o test rápido (le) .
La patente US5552292 muestra un método de diagnóstico del CRC consistente en un inmunoensayo tipo ELlSA para la detección de lactoferrina o mieloperoxidasa en heces.
El documento WO 2009/065551 Al revela un método de diagnóstico del cáncer colorrectal (CRe) a partir de muestras de heces usando como marcadores calprotectina y el complejo hemoglobina-haptoglobina.
El dispositivo de la presente invención que permite la detección simultánea y diferenciada de lactoferrina y calprotectina fecales, constituye una herramienta útil en el diagnóstico y el despistaje del cáncer colorrectal (CRe) .
Descripción breve
El método de diagnóstico de la presente invención consiste en: la toma de una porción representativa de la muestra de heces, su dispersión en un diluyente específico, la aplicación de esta dispersión de la muestra en un dispositivo inmunocromatográfico específico, la formación de complejos entre los anticuerpos del dispositivo y los antígenos de la muestra y la visualización de estos complejos...
Reivindicaciones:
1. Dispositivo inmunocromatográfico para el análisis de muestras de heces caracterizado por que comprende:
a. Una ventana de resultados de tres líneas, una de control, otra para la detección de calprotectina y otra para la detección de lactoferrina, de manera que permite la identificación simultánea y diferenciada de calprotectina y lactoferrina fecales.
b. Una membrana porosa en la que se han inmovilizado separadamente anticuerpos anti-calprotectina yanti-Iactoferrina
c. Un absorbente en el que se ha depositado conjugados de anticuerpos anti-calprotectina y anti-Iactoferrina unidos a moléculas o partículas marcadoras.
2. Dispositivo inmunocromatográfico según la reivindicación 1 caracterizado por que los anticuerpos utilizados son policlonales o monoclonales tanto en la membrana como en los conjugados.
3. Método de diagnóstico de la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) caracterizado por que comprende:
a. La obtención de una muestra de heces,
b. La dispersión del material fecal de la muestra en un tampón o diluyente,
c. La aplicación de esta dispersión en la ventana de muestra del dispositivo de la reivindicación 1,
d. La interpretación del resultado según la aparición de bandas en la ventana de resultados.
4. Método de despistaje rápido de la diarrea infecciosa (ID) caracterizado por que comprende:
a. La obtención de una muestra de heces,
b. La dispersión del material fecal de la muestra en un tampón o 5 diluyente,
c. La aplicación de esta dispersión en la ventana de muestra del dispositivo de la reivindicación 1,
d. La interpretación del resultado según la aparición de bandas en la ventana de resultados.
5. Método de ayuda al diagnóstico del cáncer colorrectal (eRe) caracterizado por que comprende:
a. La obtención de una muestra de heces,
b. La dispersión del material fecal de la muestra en un tampón o diluyente,
c. La aplicación de esta dispersión en la ventana de muestra del dispositivo de la reivindicación 1,
d. La interpretación del resultado según la aparición de bandas en la ventana de resultados.
6. Kit para llevar a cabo los métodos de diagnostico de las reivindicaciones 3, 4 Y 20 5 caracterizado porque comprende:
a. Un dispositivo inmunocromatográfico según la reivindicación 1,
b. un diluyente adecuado para suspensión y dispersión del material fecal,
c. un vial para la toma de muestra y su manipulación.
lB
lA
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FIGURA 1
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