Dispositivo para el diagnóstico de infección por Clostridium difficile.

Dispositivo para el diagnóstico de infección por Clostridium difficile.

La presente invención pertenece al campo de la detección de Clostridium difficile. En concreto, se refiere a un dispositivo inmunocromatográfico para la detección de Clostridium difficile mediante la detección simultánea y diferenciada de glutamato deshidrogenasa, de Toxina A y Toxina B de Clostridium difficile.

Dispositivo para el diagnóstico de infección por Clostridium difficile

Campo de la invención La presente invención pertenece al campo del diagnóstico de infección por Clostridium difficile. En concreto, se refiere a un dispositivo inmunocromatográfico para la detección simultánea y diferenciada de la glutamato deshidrogenasa, Toxina A y Toxina B de Clostridium difficile.

Antecedentes de la invención Clostridium difficile, un bacilo anaerobio grampositivo, es el principal agente causante de diarrea, colitis y colitis pseudomembranosa asociada a la toma de antibióticos y es uno de los patógenos entéricos más frecuentemente identificado en pacientes hospitalizados.

Los antibióticos pueden predisponer al animal huesped a la colitis pseudomembranosa y otras enfermedades relacionadas con C. difficile, debido a que alteran la microflora intestinal, la cual normalmente inhibe el crecimiento de C. difficile, generando las condiciones para que C. difficile germine, colonice la superficie colónica y secrete toxinas.

La alta frecuencia de infecciones por C. difficile, unida a la mala evolución clínica de los casos no tratados con prontitud, hacen necesaria la existencia de tests tanto para detectar de manera rápida, sencilla y precisa la infección por C. difficile como para determinar si el C. difficile presente es toxigénico o no y para evaluar la efectividad de un tratamiento contra C. difficile.

Existen cepas de C. difficile toxigénicas (que producen toxinas) y no toxigénicas (que no producen toxinas) . Las dos toxinas principales producidas por C. difficile son la Toxina A (TcdA) y la Toxina B (TcdB) . Únicamente las cepas toxigénicas, ya sean TcdA+ TcdB-, TcdA-TcdB+ o TcdA+ TcdB+, causan las enfermedades relacionadas con C. difficile, es decir, son cepas patogénicas. Las cepas no toxigénicas de C. difficile son generalmente consideradas clínicamente insignificante, mientras que las cepas toxigénicas pueden ser letales. Aunque

la distinción entre cepas de C. difficile toxigénicas y no toxigénicas es, pues, de vital importancia, ninguno de los ensayos hasta ahora utilizados supone un método ideal para el diagnóstico de una enfermedad asociada a Clostridium difficile. Los métodos comunmente utilizados para diagnosticar una infección causada por Clostridium difficile son, además de un cuadro clínico compatible, los siguientes: -Cultivo y aislamiento a partir de muestras de heces. Este método requiere condiciones anaerobias y es muy lento y costoso. Además, es un método que no tiene una alta sensibilidad, aunque permite hacer test de susceptibilidad a antibióticos de cara a un posible tratamiento. -Citotoxicidad en cultivo celular. Este método es considerado el método de referencia. Presenta una especificidad y sensibilidad cercanas al 100 %. Sin embargo, es una técnica lenta (más de dos días) , costosa (cultivo celular) y requiere personal muy especializado. -Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Es un método específico y sensible que además permite distinguir distintas variantes. Sin embargo, es caro, necesita de personal especializado y equipamiento sofisticado. -Enzimoinmunoensayos en placa (ELISA) . Detectan la presencia de las Toxinas A y B juntas o por separado. La detección de toxinas mediante métodos inmunológicos adolece de falta de sensibilidad por la a menudo baja concentración de toxinas en las muestras fecales. Para superar el problema de la baja sensibilidad se ha propuesto su utilización combinada con la detección de la glutamato deshidrogensa de C. difficile (GDH) , que presenta una buena sensibilidad y especificidad aunque no es capaz de distinguir en un único ensayo entre cepas patógenas (toxigénicas) y no patógenas (no toxigénicas) (EP 1019724 B1) . Los enzimoinmunoensayos en placa a pesar de ser más baratos que los ensayos por PCR son largos y complejos de llevar a cabo y necesitan equipamiento y personal especializado para su ejecución. -Enzimoinmunoensayos en membrana. Presentan la ventaja, respecto a los inmunoensayos en placa, de ser más sencillos y no necesitar equipamiento adicional para su ejecución. Un ejemplo es el C. DIFF QUIK CHEK (Techlab, Inc., Blacksburg, VA USA) que, además, combina la detección de GDH con las Toxinas A y B, pero no es capaz de distinguir entre ellas, es decir, no diferencia si es positivo o negativo para TcdA o para TcdB por separado. -Inmunocromatografía. Los test inmunocromatogáficos (IC) son rápidos, baratos y fáciles de llevar a cabo. En comparación con los enzimoinmunoensayos en membrana son mucho más faciles de ejecutar puesto que no llevan reactivos asociados, son más rápidos (10 min frente a 30 min.) y no necesitan conservarse en refrigeración. Existen en el mercado varios tipos

de test IC: los que detectan las toxinas A y/o B, como DUO Toxin A and B (de Vedalab) y STICK 2A-BDIFF / SIMPLE 2A-BDIFF (de Operon) , que adolecen de la misma falta de sensibilidad que el ELISA por la, a menudo, extremadamente baja concentración fecal de Toxinas A y/o B. Existen también IC que detectan la GDH como el ImmunoQuick C. difficile GDH (de Biosynex) . Los test que detectan solo GDH presentan una gran sensibilidad pero no dan información acerca de la presencia de toxinas.

En los métodos descritos anteriormente, se realiza un determinado ensayo para GDH y otro para TcdA y TcdB, lo que supone la preparación de muestras distintas y la realización de ensayos distintos. Esto, además de requerir más tiempo, implica un mayor número de manipulaciones con el inherente riesgo de error de que los resultados obtenidos para los dos parámetros no se correlacionen directamente puesto que provienen de dos muestras o técnicas diferentes.

Teniendo en cuenta todo lo anterior, los autores de la presente invención, han desarrollado un dispositivo inmunocromatográfico para la detección de C. difficile que, sorprendentemente, permite diferenciar entre cepas de C. difficile patogénicas y no, y dentro de las primeras entre cepas TcdA+ TcdB-, TcdA-TcdB+ o TcdA+ TcdB+. Además, permite la detección simultánea de GDH, TcdA y TcdB mediante la preparación de una única muestra lo que disminuye el número de manipulaciones y el riesgo de error en los resultados. La presente invención, proporciona así un método de diagnóstico de infección causada por C. difficile, basado en la utilización de dicho dispositivo inmunocromatográfico, rápido, sencillo y de fácil interpretación.

Objeto de la invención Un aspecto de la presente invención se refiere a un dispositivo inmunocromatográfico de flujo lateral para detectar C. difficile (dispositivo de la invención) caracterizado por que comprende tres tiras inmunocromatográficas: A) una tira (8´) para detectar la glutamato deshidrogenasa (GDH) de C. difficile que comprende, en el sentido del flujo:

-un primer material absorbente que comprende una zona de aplicación de la muestra (1) y una zona con micropartículas conjugadas con un primer anticuerpo anti-GDH (2´) depositadas sobre dicho primer material absorbente,

-una membrana porosa (3) con un segundo anticuerpo anti-GDH (4´) inmovilizado, y

-un segundo material absorbente (6) ; B) una tira (8´´) para detectar la Toxina A de C. difficile que comprende, en el sentido del flujo:

-un primer material absorbente que comprende una zona de aplicación de la muestra (1) y una zona con micropartículas conjugadas con un primer anticuerpo anti-toxina A (2´´) depositadas sobre dicho primer material absorbente,

-una membrana porosa (3) con un segundo anticuerpo anti-toxina A (4´´) inmovilizado, y

-un segundo material absorbente (6) ; C) una tira (8´´´) para detectar la Toxina B de C. difficile que comprende, en el sentido del flujo:

-un primer material absorbente que comprende una zona de aplicación de la muestra (1) y una zona con micropartículas conjugadas con un primer anticuerpo anti-toxina B (2´´´) depositadas sobre dicho primer material absorbente,

-una membrana porosa (3) con un segundo anticuerpo anti-toxina B (4´´´) inmovilizado, y

-un segundo material absorbente (6) .

En otro aspecto, se refiere al uso del dispositivo de la invención para el diagnóstico de infección por C. difficile.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de diagnóstico de infección por C. difficile (método de diagnóstico de la invención) que comprende las siguientes etapas:

a) tomar una muestra biológica,

b) dispersar la muestra biológica tomada en la etapa a) en un diluyente,

c) aplicar la dispersión obtenida en la etapa b) en la zona de aplicación de la muestra (1) de las tiras del dispositivo inmunocromatográfico... [Seguir leyendo]

1. Dispositivo inmunocromatográfico de flujo lateral para detectar C. difficile a partir de muestras biológicas caracterizado por que comprende tres tiras inmunocromatográficas: A) una tira (8´) para detectar la glutamato deshidrogenasa (GDH) de C. difficile que comprende, en el sentido del flujo:

-un primer material absorbente que comprende una zona de aplicación de la muestra (1) y una zona con micropartículas conjugadas con un primer anticuerpo anti-GDH (2´) depositadas sobre dicho primer material absorbente,

-una membrana porosa (3) con un segundo anticuerpo anti-GDH (4´) inmovilizado, y

-un segundo material absorbente (6) ; B) una tira (8´´) para detectar la Toxina A de C. difficile que comprende, en el sentido del flujo:

-un primer material absorbente que comprende una zona de aplicación de la muestra (1) y una zona con micropartículas conjugadas con un primer anticuerpo anti-toxina A (2´´) depositadas sobre dicho primer material absorbente,

-una membrana porosa (3) con un segundo anticuerpo anti-toxina A (4´´) inmovilizado, y

-un segundo material absorbente (6) ; C) una tira (8´´´) para detectar la Toxina B de C. difficile que comprende, en el sentido del flujo:

-un primer material absorbente que comprende una zona de aplicación de la muestra (1) y una zona con micropartículas conjugadas con un primer anticuerpo anti-toxina B (2´´´) depositadas sobre dicho primer material absorbente,

-una membrana porosa (3) con un segundo anticuerpo anti-toxina B (4´´´) inmovilizado, y

-un segundo material absorbente (6) .

2. Dispositivo según la reivindicación anterior que comprende una tira inmunocromatográfica adicional para detectar la lactoferrina fecal humana de C. difficile que comprende, en el sentido del flujo:

-un primer material absorbente que comprende una zona de aplicación de la muestra (1) y una zona con micropartículas conjugadas con un primer anticuerpo antilactoferrina depositadas sobre dicho primer material absorbente,

-una membrana porosa (3) con un segundo anticuerpo anti-lactoferrina inmovilizado, y -un segundo material absorbente (6) .

.

3. Procedimiento para el diagnóstico de infección por C. difficile caracterizado por que comprende las siguientes etapas: a) tomar una muestra biológica, b) dispersar la muestra biológica tomada en la etapa a) en un diluyente, c) aplicar la dispersión obtenida en la etapa b) en la zona de aplicación de la muestra (6) de un dispositivo inmunocromatográfico según la reivindicación 1 ó 2, d) esperar a la aparición de inmunocomplejos en la membrana porosa (3) .

4. Procedimiento según la reivindicación anterior donde la muestra biológica es una muestra fecal seleccionada del grupo formado por heces y cultivo o coprocultivos.

1.

5. Uso de un dispositivo según la reivindicación 1 ó 2 para el diagnóstico de infección por C. difficile.

6. Kit para el diagnóstico de infección por C. difficile que comprende un dispositivo según la 20 reivindicación 1 ó 2.

7. Kit según la reivindicación anterior, donde el dispositivo está introducido en una carcasa con dos ventanas para cada tira inmunocromatográfica, siendo una ventana para la aplicación de la muestra (9) y otra ventana para la visualización de los resultados (10) .

Fig. 1A

Fig. 1B Fig. 1C 8’ 8’’ 8’’’ 11

Fig. 1

Fig. 2A Fig. 2B

Fig. 2C Fig. 2D

Fig. 2E

Fig. 2

076_13_SEQ_ST25.txt SEQUENCE LISTING

<110> Certest Biotec S.L.

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