Direccionamiento y seguimiento de antígenos en células vivas.

Un polipéptido que comprende la región variable una cadena pesada de un anticuerpo de Camelidae y capaz deunirse específicamente a un epítopo de GFP,

que consiste en o comprende: marco 1, CDR1, marco 2, CDR2, marco3 y CDR3,

(a) que tiene la secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 10 o 30 o está codificado por la molécula deácido nucleico de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 11 o 31; o

(b) que está codificado por una molécula de ácido nucleico con al menos un 95% de identidad de secuencia conla SEQ ID NO: 11.

Direccionamiento y seguimiento de antígenos en células vivas La presente invención se refiere a la realización como se caracteriza específicamente en las reivindicaciones, la presente invención se refiere a una proteína de fusión que comprende una primera secuencia (poli) peptídica que comprende la región variable de un anticuerpo de cadena pesada de Camelidae (incluyendo cualquier camello o dromedario) y una segunda secuencia (poli) peptídica, que es una proteína detectable, preferentemente derivable de una proteína detectable, por ejemplo fluorescente, cromófora o fosforescente, en la que dicha (a) primera secuencia (poli) peptídica está codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NOs: 11 o 31; y (b) segunda secuencia (poli) peptídica, si deriva de una proteína fluorescente o cromófora, puede ser (i) la proteína verde fluorescente derivable de Aequorea victoria codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NOs: 7, o un mutante o fragmento fluorescente de la misma; (ii) la proteína roja fluorescente derivable de Discosoma (DsRed) codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9, o un mutante fluorescente o fragmento del mismo; o (iii) un homólogo funcional de (i) o (ii) con al menos 80% de identidad de secuencia; en la que dicha primera secuencia (poli) peptídica se localiza en dirección N terminal de dicha segunda secuencia (poli) peptídica, separándose opcionalmente dichas secuencias por un enlazador de al menos un resto de aminoácido. La presente memoria descriptiva también describe un método para purificar una estructura antigénica de interés, que comprende a) poner en contacto una muestra que contiene dicha estructura antigénica con I. una proteína de fusión dirigida a dicho estructura antigénica, en la que dicha proteína de fusión comprende una primera secuencia (poli) peptídica que comprende la región variable de un anticuerpo de cadena pesada de Camelidae y una segunda secuencia (poli) peptídica, que es una proteína detectable, preferentemente derivable de una proteína fluorescente o cromófora, en la que dicha (1.) primera secuencia (poli) peptídica está compuesta de marco 1, CDR1, marco 2, CDR2, marco 3, y CDR3, codificadas por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2 o codificadas por una secuencia de ácido nucleico con al menos 70% de identidad de secuencia o un fragmento de la misma; y (2.) segunda secuencia (poli) peptídica es una proteína detectable, preferentemente (i) la proteína verde fluorescente derivable de Aequorea victoria codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7, o un mutante o fragmento fluorescente de la misma; (ii) la proteína roja fluorescente derivable de Discosoma (DsRed) codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9, o un mutante fluorescente o fragmento del mismo; o (iii) un homólogo funcional de (i) o (ii) con al menos 80% de identidad de secuencia; en la que dicha primera secuencia (poli) peptídica está localizada en dirección N terminal o C terminal de dicha segunda secuencia (poli) peptídica, separándose opcionalmente dichas secuencias por un enlazador de al menos un resto de aminoácido, o II. un (poli) péptido que comprende la región variable de un anticuerpo de cadena pesada de Camelidae, compuesta de marco 1, CDR1, marco 2, CDR2, marco 3 y CDR3, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NOs: 2 o codificado por una secuencia de ácido nucleico con al menos 70% de identidad de secuencia o un fragmento de la misma; en la que la proteína de fusión está unida a un soporte sólido; b) opcionalmente lavar el soporte sólido de la etapa a) para retirar constituyentes unidos de forma no específica; c) eluir la estructura antigénica.

Todas o cualquier combinación de etapas (incluyendo solamente etapas únicas) llevadas a cabo en el método de la presente invención y citadas a lo largo de la presente memoria descriptiva pueden llevarse a cabo en cualquier combinación de in vivo, ex vivo o in vitro.

Los anticuerpos son herramientas valiosas para identificar y visualizar estructuras celulares. Desafortunadamente, la aplicación de anticuerpos de origen natural para la detección de antígenos intracelulares requiere permeabilización (y con frecuencia fijación) de células. Además, la detección basada en anticuerpo de los antígenos dentro de células intactas se evita esencialmente por el hecho de que están, por naturaleza, diseñadas para actuar en un ambiente oxidante (extracelular) : el ambiente reductor en el citoplasma conduce a una formación de enlaces disulfuro deficiente, dando como resultado un ensamblaje ineficaz de partes de reconocimiento de epítopos de la cadena ligera y pesada variable1, 2. Solamente en algunos casos se han usado anticuerpos intracelulares (ICAb) para afectar a la función proteica in vivo pero aún se sabe poco acerca de sus propiedades en células vivas3-7 .

En un intento de evitar los problemas asociados con la aplicación de anticuerpos en el citoplasma de células intactas, se ha estudiado en el pasado la expresión proteica fusionando proteínas de interés con proteínas fluorescentes, habitualmente GFP (“marcaje con GFP”) . El marcaje con GFP se ha convertido en un método extremadamente popular para estudiar el tráfico intracelular de proteínas y, en combinación con técnicas de fotoblanqueo de fluorescencia, ha proporcionado información única sobre la dinámica proteica en células vivas. Sin embargo, solamente puede medirse la dinámica de proteínas quiméricas, mientras que las proteínas auténticas, su modificación postraduccional así como componentes no proteicos de la célula no puede evaluarse por los métodos disponibles. Para superar estas limitaciones, sería deseable generar agentes de unión proteicos detectables que eviten los problemas y limitaciones de anticuerpos de origen natural y establecer su aplicación en la célula viva preferentemente evitando la interferencia con procesos celulares.

Por lo tanto, el problema técnico que subyace a la presente invención fue proporcionar nuevos métodos y compuestos que permitieran la detección intracelular de antígenos en células intactas. La solución a este problema técnico se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Se describe un método para detectar la presencia, cantidad o localización subcelular de una estructura antigénica de interés en una célula, que comprende las etapas de: (a) (i) expresar una proteína de fusión dirigida a la estructura antigénica de interés en dicha célula o (ii) introducir una proteína de fusión dirigida a la estructura antigénica de interés y acoplada a un (poli) péptido capaz de transducirse a dicha célula; comprendiendo dicha proteína de fusión una primera secuencia (poli) peptídica que comprende la región variable de un anticuerpo de cadena pesada de Camelidae y una segunda secuencia (poli) peptídica derivable de una proteína fluorescente o cromófora, en la que dicha (1.) primera secuencia (poli) peptídica está compuesta de marco 1, CDR1, marco 2, CDR2, marco 3 y CDR3, de un anticuerpo de Camelidae y, preferentemente, codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2

o codificada por una secuencia de ácido nucleico con al menos 70% de identidad o un fragmento de la misma y un segundo polipéptido, que es un (poli) péptido detectable (tal como un marcador) y preferentemente derivable de una proteína fluorescente o cromófora, en el que dicha (1.) primera secuencia (poli) peptídica está compuesta de marco 1, CDR1, marco 2, CDR2, marco 3 y CDR3, codificada por la secuencia de ácido nucleico de un anticuerpo de Camelidae, preferentemente de SEQ ID NO: 7, o un mutante o fragmento fluorescente de la misa; b. la proteína roja fluorescente derivable de Discosoma (DsRed) codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9, o un mutante o fragmento fluorescente de la misma; o c. un homólogo funcional de a. o b. con al menos 80% de identidad de secuencia; (b) revelar la presencia, cantidad como localización subcelular de dicha estructura antigénica de interés, si la hubiera, en dicha célula por medio de dicha proteína detectable; estando dicha primera secuencia (poli) peptídica en dirección N terminal de dicha segunda secuencia (poli) peptídica, separándose opcionalmente dichas secuencias por un enlazador de al menos un resto de aminoácido.

La expresión “localización subcelular” o “distribución” se refiere a la presencia de un compuesto, por ejemplo una proteína o un antígeno, dentro de la célula, en la célula o relacionada/conectada a la célula.

La expresión “estructura antigénica” o “antígeno” se refiere a cualquier tipo de compuesto capaz de inducir... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido que comprende la región variable una cadena pesada de un anticuerpo de Camelidae y capaz de unirse específicamente a un epítopo de GFP, que consiste en o comprende: marco 1, CDR1, marco 2, CDR2, marco 3 y CDR3,

(a) que tiene la secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 10 o 30 o está codificado por la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 11 o 31; o

(b) que está codificado por una molécula de ácido nucleico con al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 11.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, que comprende además

(a) un marcador seleccionado del grupo que consiste en marcador de His, marcador de Strep, sitio de reconocimiento para biotinilación; y opcionalmente

(b) el sitio de reconocimiento para una proteasa.

3. El polipéptido de la reivindicación 1 o 2, que comprende además una secuencia (poli) peptídica que es una proteína detectable, preferentemente derivable de una proteína fluorescente o cromófora.

4. Una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4.

6. Una célula hospedadora que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4 y/o el vector de expresión de la reivindicación 5.

7. Un método para precipitar específicamente GFP, una proteína marcada con GFP o proteínas que interaccionan con la misma en una muestra, que comprende la etapa de poner en contacto la muestra con el polipéptido de la reivindicación 1.

8. El método de la reivindicación 7, en el que el polipéptido está unido a un soporte sólido.

9. El método de la reivindicación 8, en el que el soporte sólido es sepharose.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

La lista de referencias citadas por el solicitante es, únicamente, para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.