Direccionamiento y seguimiento de antígenos en células vivas.

Un método para detectar la presencia, cantidad o localización subcelular de una estructura antigénica de interés en una célula viva,

que comprende las etapas de:

(a)

(i) expresar una proteína de fusión dirigida a la estructura antigénica de interés en dicha célula o

(ii) introducir una proteína de fusión dirigida a la estructura antigénica de interés y acoplada a un (poli)péptido capaz de transducirse en dicha célula;

en el que dicha proteína de fusión comprende una primera secuencia (poli)peptídica que comprende la región variable de un anticuerpo de cadena pesada de Camelidae y una segunda secuencia (poli)peptídica, que es un (poli)péptido detectable, preferentemente de una proteína fluorescente o cromófora, en la que dicha

1. primera secuencia (poli)peptídica está codificada por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 2 o codificada por una secuencia de ácido nucleico con al menos 70% de identidad de secuencia con la misma; y

2. segunda secuencia (poli)peptídica es una proteína detectable; preferentemente

a. la proteína verde fluorescente de Aequorea victoria codificada por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 7, o un mutante o fragmento fluorescente de la misma;

b. la proteína roja fluorescente de Discosoma (DsRed) codificada por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 9, o un mutante o fragmento fluorescente de la misma; o

c. un homólogo funcional de (a) o (b) con al menos 80% de identidad de secuencia que conserva la actividad fluorescente de la proteína fluorescente;

(b) revelar la presencia, cantidad o localización subcelular de dicha estructura antigénica de interés, si la hubiera, en dicha célula por medio de dicha proteína detectable:

en el que dicha primera secuencia (poli)peptídica está localizada en posición N-terminal de dicha segunda secuencia (poli)peptídica, estando dichas secuencias opcionalmente separadas por un enlazador de al menos un resto de un aminoácido, en el que dicho método no es un método de diagnóstico practicado en el cuerpo humano o animal.

Direccionamiento y seguimiento de antígenos en células vivas

La presente Invención se refiere a un método para detectar la presencia, cantidad o localización subcelular de una estructura antigénica de interés en una célula, que comprende las etapas de: (a) (I) expresar una proteína de fusión dirigida a la estructura antigénica de interés en dicha célula o (¡I) Introducir una proteína de fusión dirigida a la estructura antigénica de interés y acoplada con un (poli)péptldo capaz de transduclrse en dicha célula; en el que dicha proteína de fusión comprende una primera secuencia (poll)peptídlca que comprende la reglón variable de un anticuerpo de cadena pesada de Came//dae y una segunda secuencia (poll)peptídlca, que es una proteína detectable y es preferentemente de una proteína fluorescente o cromófora, en el que dicha (1.) la primera secuencia (poll)peptídlca se codifica por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 2 o está codificada por una secuencia de ácido nucleico con al menos el 70% de Identidad de secuencia; y (2.) la segunda secuencia (poll)peptídlca es una proteína detectable: preferentemente (a.) la proteína verde fluorescente de Aeguorea v/cfor/a codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7, o un mutante fluorescente o fragmento del mismo; (b.) la proteína fluorescente roja de D/scosoma (DsRed) codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9, o un mutante fluorescente o fragmento de la misma; o (c.) un homólogo funcional de (a.) o (b.) con al menos 80% de identidad de secuencia que conserva la actividad fluorescente de la proteína de fusión, (b) revelar la presencia, cantidad o localización subcelular de dicha estructura antigénica de Interés, si la hubiera, en dicha célula por medio de dicha proteína detectable; en el que dicha primera secuencia (poll)peptídlca se localiza en el extremo N-terminal de dicha segunda secuencia (poll)peptídlca, estando dichas secuencias opclonalmente separadas por un enlazador de al menos un resto de aminoácido. Además, se describe una proteína de fusión que comprende una primera secuencia (poli)peptídica que comprende la reglón variable de un anticuerpo de cadena pesada de Came//cfae (Incluyendo cualquier camello o dromedario) y una segunda secuencia (poll)peptídlca, que es una proteína detectable, preferentemente derivable de una proteína detectable, por ejemplo fluorescente, cromófora o fosforescente, en la que dicha (a) primera secuencia (poll)peptídlca está codificada por la secuencia del ácido nucleico SEQ ID NO: 11, 31, 13 o 15; y (b) segunda secuencia (poll)peptídlca, si deriva de una proteína fluorescente o cromófora, es (I) la proteína verde fluorescente derivable de Aeguorea v/cfor/a codificada por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 7, o un mutante o fragmento fluorescente de la misma; (¡i) la proteína roja fluorescente derivable de D/scosoma (DsRed) codificada por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 9, o un mutante fluorescente o fragmento del mismo; o (¡ü) un homólogo funcional de (I) o (¡I) con al menos el 80% de identidad de secuencia; en la que dicha primera secuencia (poli)peptídica se localiza en dirección N-terminal de dicha segunda secuencia(poli) peptídica, separándose opclonalmente dichas secuencias por un enlazador de al menos un resto de aminoácido. Finalmente se describe un método para purificar una estructura antigénica de interés, que comprende a) poner en contacto una muestra que contiene dicha estructura antigénica con I. una proteína de fusión dirigida a dicha estructura antigénica, en la que dicha proteína de fusión comprende una primera secuencia (poli)peptídica que comprende la región variable de un anticuerpo de cadena pesada de CameZ/dae y una segunda secuencia (poli)peptídica, que es una proteína detectable, preferentemente derivable de una proteína fluorescente o cromófora, en la que dicha (1.) primera secuencia (poli)peptídlca está compuesta por marco 1, CDR1, marco 2, CDR2, marco 3, y CDR3, codificadas por la secuencia del ácido nucleico SEQ ID NO: 2 o codificadas por una secuencia de un ácido nucleico con al menos 70% de identidad de secuencia o un fragmento de la misma; y (2.) segunda secuencia (poll)peptídlca es una proteína detectable, preferentemente (I) la proteína verde fluorescente derivable de Aeguorea v/cfor/a codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQSEQ ID NO: 7, o un mutante o fragmento fluorescente de la misma; (¡I) la proteína roja fluorescente derivable de D/scosoma (DsRed) codificada por la secuencia del ácido nucleico SEQ ID NO: 9, o un mutante fluorescente o fragmento del mismo; o (iii) un homólogo funcional de (i) o (¡i) con al menos 80% de Identidad de secuencia; en la que dicha primera secuencia (poli)peptídica está localizada en dirección N- termlnal o C-termlnal de dicha segunda secuencia (poll)peptídlca, separándose opcionalmente dichas secuencias por un enlazador de al menos un resto de aminoácido, o II. un (poll)péptldo que comprende la región variable de un anticuerpo de cadena pesada de CameZ/dae, compuesta por marco 1, CDR1, marco 2, CDR2, marco 3 y CDR3, codificado por la secuencia del ácido nucleico SEQ ID NO: 2 o codificado por una secuencia de un ácido nucleico con al menos 70% de Identidad de secuencia o un fragmento de la misma; en la que la proteína de fusión está unida a un soporte sólido; b) opclonalmente lavar el soporte sólido de la etapa a) para retirar componentes unidos de forma no específica; c) eluir la estructura antigénica.

Todas o cualquier combinación de las etapas (incluyendo solamente etapas únicas) llevadas a cabo en el método de la presente Invención y citadas a lo largo de la presente memoria descriptiva pueden llevarse a cabo en cualquier combinación de /n v/vo, ex v/vo o /n v/fro.

Los anticuerpos son herramientas valiosas para identificar y visualizar estructuras celulares. Desafortunadamente, la aplicación de anticuerpos de origen natural para la detección de antígenos ¡ntracelulares requiere la permeablllzaclón (y con frecuencia fijación) de células. Además, la detección de antígenos basada en anticuerpos dentro de células Intactas se evita esencialmente por el hecho de que están, por naturaleza, diseñadas para actuar en un ambiente oxidante (extracelular): el ambiente reductor en el citoplasma conduce a una formación de enlaces disulfuro deficiente, dando

como resultado un ensamblaje ineficaz de partes de reconocimiento de los epítopos de la cadena ligera y pesada variables^. Solamente en algunos casos se han usado anticuerpos intracelulares (ICAb) para afectar a la función proteica /n v/vo pero aún se sabe poco acerca de sus propiedades en células vivas^.

En un intento de evitar los problemas asociados con la aplicación de anticuerpos en el citoplasma de células intactas, se ha estudiado en el pasado la expresión proteica fusionando las proteínas de interés con proteínas fiuorescentes, habitualmente GFP ("mareaje con GFP"). El mareaje con GFP se ha convertido en un método extremadamente popular para estudiar el tráfico intracelular de proteínas y, en combinación con técnicas de fotoblanqueo de fluorescencia, ha proporcionado información única sobre la dinámica proteica en células vivas. Sin embargo, solamente puede medirse la dinámica de proteínas quiméricas, mientras que las proteínas auténticas, su modificación postraduccional así como componentes no proteicos de la célula, no pueden evaluarse por los métodos disponibles. Para superar estas limitaciones, sería deseable generar agentes de unión proteicos detectables que eviten los problemas y limitaciones de los anticuerpos de origen natural y establecer su aplicación en la célula viva preferentemente evitando la interferencia con procesos celulares.

Por lo tanto, el problema técnico que subyace a la presente invención fue proporcionar nuevos métodos y compuestos que permitan la detección intracelular de antígenos en células intactas. La solución a este problema técnico se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

En consecuencia, la presente invención se refiere a un método para detectar la presencia, cantidad o localización subcelular de una estructura antigénica de interés en una célula, que comprende las etapas de: (a) (i) expresar una proteína de fusión dirigida a la estructura antigénica de interés en dicha célula o (¡i) introducir una proteína de fusión dirigida a la estructura antigénica de interés y acoplada a un (poli)péptido capaz de transducirse a dicha célula; comprendiendo dicha proteína de fusión una primera secuencia (poli)peptídica que comprende la región variable de un anticuerpo de cadena pesada de Came//dae y una segunda secuencia (poli)peptídica preferentemente... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar la presencia, cantidad o localización subcelular de una estructura antigénica de interés en una célula viva, que comprende las etapas de:

(a)

(I) expresar una proteína de fusión dirigida a la estructura antigénica de Interés en dicha célula o

(¡I) Introducir una proteína de fusión dirigida a la estructura antigénica de Interés y acoplada a un (poll)péptido

capaz de transduclrse en dicha célula;

en el que dicha proteína de fusión comprende una primera secuencia (poll)peptídlca que comprende la región variable de un anticuerpo de cadena pesada de CameZ/dae y una segunda secuencia (poll)peptídlca, que es un (poll)péptldo detectable, preferentemente de una proteína fluorescente o cromófora, en la que dicha

1. primera secuencia (poll)peptídlca está codificada por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 2 o codificada por una secuencia de ácido nucleico con al menos 70% de Identidad de secuencia con la misma; y

2. segunda secuencia (poll)peptídlca es una proteína detectable; preferentemente

a. la proteína verde fluorescente de Aeguorea v/cfor/a codificada por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 7, o un mutante o fragmento fluorescente de la misma;

b. la proteína roja fluorescente de Dlscosoma (DsRed) codificada por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 9, o un mutante o fragmento fluorescente de la misma; o

c. un homólogo funcional de (a) o (b) con al menos 80% de Identidad de secuencia que conserva la actividad fluorescente de la proteína fluorescente;

(b) revelar la presencia, cantidad o localización subcelular de dicha estructura antigénica de Interés, si la hubiera, en dicha célula por medio de dicha proteína detectable:

en el que dicha primera secuencia (poll)peptídlca está localizada en posición N-termlnal de dicha segunda secuencia (poli)peptídica, estando dichas secuencias opclonalmente separadas por un enlazador de al menos un resto de un aminoácido, en el que dicho método no es un método de diagnóstico practicado en el cuerpo humano o animal.

2. El método de la reivindicación 1 en el que la etapa (b) comprende

(a) exponer la célula a luz correspondiente a la longitud de onda de excitación de la proteína de fusión;

(b) detectar la energía emitida por la célula y/o detectar la distribución subcelular de la energía emitida;

(c) comparar la energía detectada en la etapa (b) con:

I. la energía detectada en una célula de referencia que contiene una cantidad de referencia de dicha estructura antigénica de Interés; o expresa una proteína de fusión de referencia para la que no se expresa ningún compañero de fusión en la célula; o ¡I. un control de datos;

(d) sacar conclusiones a partir de una energía diferente sobre el estado de salud de un individuo o evaluar la presencia de la estructura antigénica de interés; en el que una mayor energía detectada en la etapa (b) en comparación con la de la etapa (c) es indicativa de la presencia de dicho antígeno; y/o sacar conclusiones a partir de la cantidad y distribución subcelular de la energía emitida con respecto a la cantidad o localización subcelular de la estructura antigénica de interés.

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la célula es una célula obtenida de un individuo.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha célula es una célula dentro de un organismo eucariota vivo.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha estructura antigénica se selecciona de entre proteína, modificación proteica, cofactor, compuesto molecular pequeño, ADN y ARN.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho (poli)péptido capaz de transducirse se selecciona del grupo de (poli)péptidos básicos que comprenden péptido TAT, poliarginina y polilisina.

7. El método de la reivindicación 1, en el que la secuencia de

(a) CDR1 consiste en los restos mostrados en SEQ ID NO: 3;

(b) CDR2 consiste en los restos mostrados en SEQ ID NO: 4; y

(c) CDR3 consiste en los restos mostrados en SEQ ID NO: 5.

8. El método de la reivindicación 1 o 7, en el que dicha primera secuencia (poll)peptídlca de dicha proteína de fusión o el (poll)péptldo que comprende la región variable de un anticuerpo de cadena pesada de CameZ/dae tiene cualquier secuencia de SEQ ID NO: 10, 30, 12 o 14 o está codificada porSEQ ID NO: 11, 31, 13 o 15.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 7 u 8, en el que dicha segunda secuencia (poll)peptídlca de dicha proteína de fusión comprende los restos 1 a 239 de SEQ ID NO: 6 o 1 a 226 de SEQ ID NO: 8 o un mutante o fragmento fluorescente de la misma.

10 10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 7 a 9, en el que dicho mutante de la proteína roja

fluorescente es mRFP1 como se muestra en SEQ ID NO: 17 o una proteína o (poll)péptldo codificado por cualquier secuencia de SEQSEQ ID NO 17 y 24 a 27.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 7 a 10, en el que dicha proteína de fusión comprende 15 una secuencia de dirección seleccionada del grupo que consiste en señal de localización nuclear (NLS), secuencia

de Importación a retículo endoplásmico, secuencia de Importación mltocondrlal.

12. El método de la reivindicación 1, en el que dicha proteína de fusión tiene una secuencia de una cualquiera de SEQSEQ ID NO: 18, 32, 20 o 22 o está codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende cualquier

20 secuencia de SEQSEQSEQ ID NO: 19, 33, 21 o 23.