delta 4,5 Glicuronidasa y usos de la misma.

Una glicuronidasa Δ4,5-insaturada sustancialmente pura o aislada con una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas a un ácido nucleico con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 2 o la SEC ID Nº: 4.

L 4, 5-glicuronidasa y usos de la misma.

Campo de la invención

La invención se refiere a L 4, 5-glicuronidasa y usos de la misma. En particular, la invención se refiere a L 4, 5glicuronidasa sustancialmente pura que es útil para una variedad de fines, incluyendo análisis de glicosaminoglicanos (los GAG) , secuenciación, identificación, cuantificación y purificación de glicosaminoglicanos presentes en una muestra, eliminación de glicosaminoglicanos, tales como heparina, de una disolución e inhibición de angiogénesis, control de la coagulación, etc. La invención también se refiere a métodos de tratamiento del cáncer e inhibición de proliferación celular y/o metástasis usando L 4, 5-glicuronidasa y/o fragmentos de GAG producidos por escisión enzimática con L 4, 5-glicuronidasa.

Antecedentes de la invención Los glicosaminoglicanos (los GAG) son polisacáridos ácidos lineales que existen ubicuamente en la naturaleza como residentes de la matriz extracelular y en la superficie celular de muchos organismos diferentes de filogenia divergente [Habuchi o. (2.000) Biochim Biophys Acta 1.474, 115-27; Sasisekharan, R., Bulmer, M., Moremen, K. W., Cooney, C. L. y Langer, R. (1.993) Proc Natl Acad Sci USA 90, 3.660-4]. Además de una función estructural, los GAG actúan como moduladores críticos de una serie de procesos de señalización bioquímica [Tumova, S., Woods,

A. y Couchman, J. R. (2.000) Int J Biochem Cell Biol 32, 269-88] requisito para crecimiento y diferenciación celular, adhesión y migración celular y morfogénesis de tejidos.

Los glicosaminoglicanos tipo heparán sulfato (los GAG o los HSGAG) están presentes tanto en la superficie celular como en la matriz extracelular. Los glicosaminoglicanos de tipo heparina son componentes importantes de la matriz extracelular que se cree que regulan una amplia variedad de actividades celulares incluyendo invasión, migración, proliferación y adhesión (Khodapkar, et al. 1.998; Woods, et al., 1.998) . Los HSGAG realizan algunas de estas funciones por unión a, y regulando las actividades biológicas de, diversas moléculas, incluyendo factores de crecimiento, morfógenos, enzimas, proteínas extracelulares. Los HSGAG son un grupo de polisacáridos complejos de longitud variable, que consisten en una unidad disacárida de repetición constituida por glucosamina y un ácido urónico (ácido idurónico o glucurónico) . El alto grado de complejidad para los HSGAG no sólo surge de su polidispersidad y la posibilidad de dos componentes de ácido urónico diferentes, sino también de la modificación diferencial en cuatro posiciones de la unidad disacárida. Tres posiciones, a saber, C2 del ácido urónico y las posiciones C3, C6 de la glucosamina pueden ser O-sulfatadas. Además, C2 de la glucosamina puede ser Nacetilada o N-sulfatada. Además, estas modificaciones podían conducir teóricamente a 32 posibles unidades disacáridas, haciendo los HSGAG potencialmente más densos en información que cualquier ADN (4 bases) o proteínas (20 aminoácidos) . Es esta inmensidad de posibles variantes estructurales lo que permite que los HSGAG estén implicados en un gran número de procesos biológicos diversos, incluyendo angiogénesis (Sasisekharan, R., Moses, M. A., Nugent, M. A., Cooney, C. L. y Langer, R. (1.994) Proc Natl Acad Sci USA, 1.524-8.) , embriogénesis ( Binari, R. et al (1.997) Development, 2.623-32; Tsuda, M., et al. (1.999) Nature, 276-80. y Lin, X., et al (1.999) Development, 3.715-23.) y la formación de fibrillas-β en la enfermedad de Alzheimer (McLaurin, J., et al (1.999) Eur J Biochem, 1.101-10. y Lindahl, B., et al (1.999) J Biol Chem, 30.631-5) .

Un ejemplo específico de un HSGAG es heparina. La heparina, un HSGAG altamente sulfatado producido por los mastocitos, es un anticoagulante clínico usado extensamente y es uno de los cebador os fármacos biopoliméricos y uno de los pocos fármacos de carbohidratos. La heparina provoca principalmente su efecto por dos mecanismos, implicando los dos la unión de antitrombina III (AT-III) a una secuencia de pentasacáridos específica, HNAC/S, 6SGHNS, 3S, 6SI2SHNS, 6S contenida dentro del polímero. Los HSGAG han surgido también como piezas clave en una serie de procesos biológicos que oscilan desde angiogénesis [Folkman, J., Taylor, S. y Spillberg, C. (1.983) Ciba Found Symp 100, 132-49] y biología del cáncer [Blackhall, F. H., Merr y , C. L., Davies, E. J. y Jayson, G. C. (2.001) Br J Cáncer 85, 1.094-8] a patogénesis microbiana [Shukla, et al (1.999) Cell 99, 13-22]. Los HSGAG también han mostrado recientemente que desempeñan una función fundamental en múltiples aspectos de desarrollo [Perrimon,

N. y Bernfield, M. (2.000) Nature 404, 725-8]. La capacidad de los HSGAG para disponer múltiples procesos biológicos es probablemente de nuevo una consecuencia de su complejidad estructural y densidad de información [Sasisekharan, R. y Venkataraman, G. (2.000) Curr Opin Chem Biol 4, 626-31].

Aunque la estructura y la química de los HSGAG se entienden bastante bien, la información sobre cómo las secuencias de HSGAG específicas modulan diferentes procesos biológicos se ha demostrado más complicada de obtener. La determinación de esta secuencia de HSGAG se ha cuestionado técnicamente. Los HSGAG están presentes de manera natural en cantidades muy limitadas, que, a diferencia de otros biopolímeros tales como proteínas y ácidos nucleicos, no se pueden multiplicar fácilmente. Segundo, debido a su carácter altamente cargado y heterogeneidad estructural, los HSGAG no se aíslan fácilmente de fuentes biológicas en un estado altamente purificado. Adicionalmente, la ausencia de herramientas específicas de la secuencia para escindir los HSGAG de una manera análoga a secuenciación o mapeo de restricción de ADN ha hecho un reto la secuenciación.

Recientemente, en un esfuerzo para desarrollar un entendimiento de la estructura de HSGAG, se ha puesto el enfoque en la clonación y caracterización de las enzimas implicadas en la biosíntesis de HSGAG. Otra estrategia para elucidar la estructura de los HSGAG ha sido emplear procedimientos de degradación de HSGAG específicos, incluyendo escisión química o enzimática, junto con metodologías analíticas, incluyendo electroforesis de gel o HPLC, para secuenciar los HSGAG. Recientemente, se ha introducido un procedimiento de secuenciación que acopla un entramado bioinformático con procedimientos de espectrometría de masas y electroforéticos capilares para secuenciar rápidamente los HSGAG biológicamente importantes, incluyendo secuencias de sacáridos implicadas en la modulación de anticoagulación. La metodología de secuenciación usa herramientas químicas y enzimáticas para modificar o degradar un polímero de glicosaminoglicano desconocido de una manera específica de la secuencia. (Venkataraman, G., et al., Science, 286, 537-542 (1.999) y Solicitudes de Patente de EE.UU. Nos. de Serie 09/557.997 y 09/558.137, ambas presentadas el 24 de abril de 2.000, con propiedad de la invención común)

Sumario de la invención Se ha clonado L4, 5-glicuronidasa a partir del genoma F. heparinum y se ha realizado su posterior expresión recombinante en E. coli como una enzima muy activa, soluble. Así, en un aspecto la presente invención proporciona una L4, 5-glicuronidasa sustancialmente pura con una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas a un ácido nucleico con la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4. En una realización de la invención, la L4, 5-glicuronidasa sustancialmente pura es una glicuronidasa producida de manera recombinante. La expresión recombinante se puede realizar en una realización con un vector de expresión. Un vector de expresión puede ser un ácido nucleico para la SEC ID Nº: 2 opcionalmente unido de manera operable a un activador. En otra realización, el vector de expresión puede ser un ácido nucleico para la SEC ID Nº: 4 o una variante del mismo también opcionalmente unida a un activador. En otra realización, el vector de expresión puede ser una molécula de ácido nucleico que codifique la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3. En una realización, la L4, 5-glicuronidasa sustancialmente pura se produce usando una célula huésped que comprende el vector de expresión. En otra realización, la L4, 5-glicuronidasa sustancialmente pura es una glicuronidasa sintética.

En otro aspecto, la glicuronidasa de la invención es un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 1 o una variante funcional de la misma. En otro aspecto más, el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 3 o una variante funcional de la misma.

En otro aspecto más de la invención, el polipéptido de la... [Seguir leyendo]

1. Una glicuronidasa L4, 5-insaturada sustancialmente pura o aislada con una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas a un ácido nucleico con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 2 o la SEC ID Nº: 4.

2. Una glicuronidasa según la reivindicación 1, en la que la glicuronidasa comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 o la SEC ID Nº: 3.

3. Una composición que comprende la glicuronidasa L4, 5-insaturada como se definió en la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

4. Una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada del grupo que consiste en:

a) moléculas de ácido nucleico que hibridan en condiciones rigurosas a una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótidos mostrada como la SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4 y que codifican una glicuronidasa L4, 5insaturada,

b) moléculas de ácido nucleico que difieren de las moléculas de ácido nucleico de (a) en secuencia de codones debido a degeneración del código genético y

c) complementos de (a) o (b) .

5. Una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 4, en la que la molécula de ácido nucleico aislada se codifica para la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3.

6. Una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 4, en la que la molécula de ácido nucleico aislada comprende la secuencia de nucleótidos mostrada como la SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4.

7. Un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico aislada según cualquiera de las reivindicaciones 4-6, unido de manera operable a un activador.

8. Una célula huésped que comprende un vector de expresión según la reivindicación 7.

9. Una preparación farmacéutica que comprende:

una glicuronidasa según la reivindicación 1 ó 2, una composición según la reivindicación 3, un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 4-6 o un vector según la reivindicación 7 y un portador farmacéuticamente aceptable.

10. Un método in vitro para escindir un glicosaminoglicano, que comprende poner en contacto un glicosaminoglicano con una glicuronidasa según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o una composición según la reivindicación 3.

11. Un método in vitro de eliminación de heparina de un fluido que contiene heparina, que comprende poner en contacto un fluido que contiene heparina con una glicuronidasa según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o una composición según la reivindicación 3.

12. Un método según la reivindicación 11, en el que la glicuronidasa se inmoviliza sobre un soporte sólido, preferiblemente en el que también se inmoviliza la heparinasa sobre el soporte sólido.

13. Un método para analizar un glicosaminoglicano, que comprende poner en contacto un glicosaminoglicano con una glicuronidasa según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o una composición según la reivindicación 3.

14. Un método según la reivindicación 13, en el que el método es un método para: a) identificar la presencia de un glicosaminoglicano particular en una muestra, b) determinar la pureza de un glicosaminoglicano en una muestra, c) determinar la composición de un glicosaminoglicano en una muestra y/o d) determinar la secuencia de unidades sacáridas en un glicosaminoglicano.

15. Un método según la reivindicación 14, en el que el método es un método para determinar la secuencia de unidades sacáridas en un glicosaminoglicano, que comprende además una técnica analítica adicional seleccionada del grupo que consiste en: espectrometría de masas, espectroscopía de RMN, electroforesis en gel, electroforesis capilar y HPLC.

16. Un método in vitro según la reivindicación 10, en el que el glicosaminoglicano comprende al menos una unidad disacárida.

17. Un método según la reivindicación 16, en el que la longitud del glicosaminoglicano excede de dos unidades sacáridas y/o en el que el glicosaminoglicano consta de:

a) unidades disacáridas LUHNAc,

b) unidades disacáridas LUHNAc, 6S,

c) unidades disacáridas LUHNS, 6S,

d) unidades disacáridas LUHNS y/o e) LUHNH2, 6S.

en el que LU es un ácido urónico, H es una hexosamina, NAc es N-acetilación, 6S es sulfatación de C6, NS es Nsulfatación y NH2 es una amina.

18. Un método según la reivindicación 16, en el que el glicosaminoglicano: a) no contiene un uronidato 2-0 sulfatado, b) es 6-0 sulfatado y/o c) contiene una glicosamina N-no sustituida.

19. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 10, 11, 13 ó 16, en el que el uso de la glicuronidasa es concurrente con o sigue un tratamiento con heparinasa.

20. Un método según la reivindicación 13 o la reivindicación 16, en el que el glicosaminoglicano es heparina, heparina de bajo peso molecular (LMWH) o heparán sulfato.

21. Una preparación farmacéutica según la reivindicación 9 o un glicosaminoglicano preparado por el método según la reivindicación 10, para uso en: a) inhibición de la angiogénesis, b) tratamiento del cáncer,

c) inhibición de la proliferación celular y/o d) tratamiento de un trastorno de la coagulación.

22. Una glicuronidasa según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, una composición según la reivindicación 3, un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 4-6 o un vector según la reivindicación 7, para uso en tratamiento.