Compuestos y métodos para la síntesis y purificación de oligonucleótidos.

Un compuesto con la fórmula (I):

PR1R2R3 (I)

en el que R1 se selecciona a partir del grupo que consiste en alquiloxi C1-C8-,

alqueniloxi C2-C8- y alquiniloxi C2-C8-, opcionalmente sustituido con CN;

R2 es un halógeno o -NR42;

R3 tiene la fórmula - L-A;

cada R4 es un alquilo C1-C6 o está combinado para formar un anillo heterocíclico de 4 a 7 miembros,opcionalmente sustituido con 1-3 sustituyentes seleccionados a partir del grupo que consiste en alquilo C1-C6-,haloalquilo C1-C6-, alcoxi C1-C6 , arilalcoxi C1-C6-, oxo- y alcoxicarbonilo C1-C6;

L es un alquilenoxi C1-C10-, que se sustituye opcionalmente con 1-3 sustituyentes seleccionados a partir delgrupo que consiste en alquilo C1-C6 -, haloalquilo C1-C6-, alcoxi C1-C6-, arilalcoxi C1-C6-, oxo- y alcoxicarboniloC1-C6-; y

A es un perfluoroalquilo C1-C30;

y donde un grupo alquilo hace referencia a una porción de hidrocarburo saturado lineal, ramificado o cíclico,con la condición de que se excluyan el compuesto con la fórmula PR1R2R3,

en el que R1 es -OCH2CH2,CN, R2 es -N(i-Pr)2 y R3 es -OCH2CF3 y el compuesto con fórmula PR1R2R3, dondeR1 es -O-terc-butilo, R2 es -N(Et)2, y R3 es - OCOCF3.

Compuestos y métodos para la síntesis y purificación de oligonucleótidos Campo de la invención Generalmente, la invención hace referencia a la química de los ácidos nucleicos y a la biología molecular. Más específicamente, la invención proporciona métodos de síntesis y purificación de ácidos nucleicos además de los reactivos de protección química, así como composiciones, kits y sistemas que incluyen tales reactivos. La invención puede utilizarse para varios propósitos industriales, médicos y forenses.

Antecedentes de la invención La invención hace referencia a los compuestos y métodos para la síntesis y purificación de oligonucleótidos, y más específicamente, a compuestos y métodos para la síntesis, protección química y purificación de ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos tienen una gran importancia en el mundo de los seres vivos ya que son transportadores y transmisores de la de información genética. Desde su descubrimiento por F. Miescher han despertado un amplio interés científico que ha llevado al descubrimiento de su función, estructura y mecanismo de acción. A menudo, las variaciones en la secuencia de los ácidos nucleicos son responsables de las diferencias en la susceptibilidad a enfermedades y las respuestas farmacológicas a un tratamiento. Para ilustrar esto, los cambios en una sola base de una molécula de ácido nucleico, a los que se les llama polimorfismos de nucleótido simples (SNP) , pueden afectar al riesgo de un individuo de contraer una enfermedad concreta. Mediante la comparación de estas variaciones, los investigadores han logrado el entendimiento de la utilidad médica de los SNP, potenciando así nuestra capacidad para diagnosticar, pronosticar y tratar enfermedades de forma efectiva. Además, se utilizan nucleótidos sintéticos purificados para la amplificación en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y otros métodos de amplificación; como cebadores; sondas de hibridación para la detección y/o secuenciación, terapia génica, clonación, estudios de mutagénesis específicos de locus y similares. La calidad de los resultados de estas técnicas está directamente relacionada con la pureza de los oligonucleótidos utilizados.

Como tal, la pureza de una molécula de ácido nucleico es crucial para elucidar la función y facilitar la manipulación de estas moléculas. La síntesis en fase sólida automatizada es el enfoque más común para la producción de oligonucleótidos cortos. Habitualmente, estos métodos sintéticos se basan en reacciones paso a paso de derivados de fosforamidita o H-fosfonato de nucleósidos para formar enlaces continuos de estos bloques de construcción monoméricos en un orden predeterminado (véase por ejemplo, T. Brown & D. J. S. Brown en Oligonucleotides and Analogues--A Practical Approach, (1991) (Eckstein, F., publ. IRL Press en Oxford University Press, Oxford, N.Y., Tokyo) ; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning-A Laborator y Manual, Cold Spring Harbor Laborator y , Cold Spring Harbor, Nueva York; Oligonucleotides Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984) ; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames y S.

J. Higgins, eds., 1984) ; Current Protocols in Nucelic Acid Chemistr y , Beaucage, S. L.; Bergstrom, D. E.; Glick, G. D.; Jones, R. A., Eds., John Wiley & Sons, Inc.: Nueva York, Capítulos 1-4, 2000-2004; y un serie, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.) . No obstante, los oligonucleótidos resultantes son mezclas heterogéneas de secuencias, lo que complica la purificación y limita la medida en la que se pueden elaborar los oligonucleótidos, así como el rendimiento resultante. El problema de la purificación aumenta en relación al aumento de la longitud de la cadena. Habitualmente, los grupos 5’-hidroxilo que no han reaccionado se protegen químicamente con anhidruro acético para prevenir la elongación futura de la cadena con una secuencia “fallida” incorrecta. Las patentes US 2002/055623 y US 4816571 describen la utilización de anhidruro acético y fosfito monoéster como reactivos protectores para proteger las secuencias fallidas de oligonucleótidos. No obstante, ninguno de los documentos describe la utilización de reactivos protectores que contienen perfluoroalquilo para proteger las secuencias fallidas de oligonucleótidos, lo que resulta en la formación de secuencias fallidas protegidas que pueden separarse del oligonucleótido diana utilizando la purificación de afinidad fluorosa. Otro método, que puede realizarse en paralelo, es la llamada purificación en tritilo (TOP) , que utiliza la liofilicidad de los grupos protectores de tritilo. La secuencia deseada que incluye el grupo protector de tritilo se retiene en un material de soporte lipofílico mientras se sustraen las secuencias fallidas que no tienen el grupo tritilo. Tras la escisión del grupo tritilo bajo condiciones acídicas, se puede eludir el producto de la secuencia deseada del soporte lipofílico.

Se utilizan varios métodos para la purificación de oligonucleótidos – la cromatografía de fase reversa mencionada con anterioridad, la cromatografía de intercambio aniónico (AX) , la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) , la precipitación de etanol, o una combinación de estas técnicas.

No obstante, estos métodos tienen la desventaja de que tanto los grupos acilo como los tritilo son relativamente lábiles a las condiciones empleadas en la síntesis de oligonucleótidos (por ejemplo, las condiciones típicas de desprotección de los oligonucleótidos incluyen la incubación en amonio acuoso a 55-60 °C durante 16 horas) , lo que resulta en una purificación pobre o en rendimientos bajos. Estos métodos también están limitados porque las interacciones hidrofóbicas no son particularmente fuertes, por lo que la eficiencia del aislamiento disminuye rápidamente con el aumento de la longitud de la cadena. Consecuentemente, estos métodos están limitados a producir nucleótidos de menos de 100 nucleótidos con rendimientos bajos para la secuencia deseada.

Las estrategias de afinidad fluorosa se han utilizado para la purificación de péptidos (véase Filippov et al Tetrahedron Lett. 2002, 43: 7809-7812; de Visser et al; Tetrahedron Lett 2003 44: 9013-9016; Montanari et al. J Am. Chem. Soc. 2004, 126: 9528; Brittain et al. Nature Biotechnol. 2005 23: 463-468; Markowicz et al. Synthesis 2004 80-86; Mizuno et al. Chem. Lett 2005 34: 426-427) , oligosacáridos (vease Palmacci et al. Angew. Chem. Int. Ed 2001, 40: 4433; Manzoni Chem. Commun. 2003, 2930-2931 y Goto et al Synlett 2004, 2221-2223) . Las estrategias de afinidad fluorosa también se han utilizado para la purificación de oligonucleótidos (véase Pearson et al. J. Org. Chem. 2005 70: 71147122; Beller Helv. Chim. Acta 2005, 88: 171-179; Berr y et al. WO 2006/081035, Publicación de patente de EE.UU. Nº 2006/0178507) pese a que estos informes sólo describen la utilización de grupos tritilo fluorosos. Tal y como se menciona con anterioridad, habitualmente los grupos protectores de acetato y tritilo no sobreviven a las condiciones de desprotección que típicamente se emplean en la síntesis de oligonucleótidos. Además, Berr y et al. utiliza DMTr fluoroso para marcar el material de longitud completa. Sus materiales purificados- fluorosos son una distribución del producto de longitud completa más la deleción esperada de oligonucleótidos (es decir, n-1, n-2, etc.) , dado que el acoplamiento final de la fosforamidita añadió un nucleótido protegido-fluoroso a la distribución preexistente de la cadena deseada más los materiales de deleción, que no puede resolverse mediante HPLC, pero que puede detectarse mediante el análisis de electroforesis capilar.

La presente invención soluciona estos problemas mediante la provisión de un protector de afinidad fluoroso basado en fósforo para proteger las secuencias fallidas, un método que puede utilizarse independientemente del nucleósido utilizado. El método utiliza una combinación de protección fluorosa y cromatografía por afinidad fluorosa que resulta en mayores rendimientos y purezas de oligonucleótidos no protegidos que no poseen las secuencias fallidas, incluso con oligómeros largos (>15meros) .

Breve resumen de la invención El objetivo anterior se logra mediante compuestos de protección con la fórmula (I) :

PR1R2R3 (I)

En el que R1 se selecciona a partir del grupo que consiste en alquiloxi C1-C8-, alqueniloxi C2-C8- y alquiniloxi C2-C8-, opcionalmente sustituido con CN;

R2 es un halógeno o NR42;

R3 tiene la fórmula – L-A;

cada R4 es un alquilo C1-C6 o está combinado para formar un anillo heterocíclico de 4 a 7 miembros, opcionalmente sustituido con 1-3 sustituyentes seleccionados a partir del grupo que consiste en alquilo C1-C6-, haloalquilo... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto con la fórmula (I) :

PR1R2R3 (I)

en el que R1 se selecciona a partir del grupo que consiste en alquiloxi C1-C8-, alqueniloxi C2-C8- y alquiniloxi C2- C8-, opcionalmente sustituido con CN; R2 es un halógeno o -NR42; R3 tiene la fórmula – L-A; cada R4 es un alquilo C1-C6 o está combinado para formar un anillo heterocíclico de 4 a 7 miembros,

opcionalmente sustituido con 1-3 sustituyentes seleccionados a partir del grupo que consiste en alquilo C1-C6-,

haloalquilo C1-C6-, alcoxi C1-C6 , arilalcoxi C1-C6-, oxo- y alcoxicarbonilo C1-C6; L es un alquilenoxi C1-C10-, que se sustituye opcionalmente con 1-3 sustituyentes seleccionados a partir del grupo que consiste en alquilo C1-C6 -, haloalquilo C1-C6-, alcoxi C1-C6-, arilalcoxi C1-C6-, oxo- y alcoxicarbonilo C1-C6-; y

A es un perfluoroalquilo C1-C30; y donde un grupo alquilo hace referencia a una porción de hidrocarburo saturado lineal, ramificado o cíclico, con la condición de que se excluyan el compuesto con la fórmula PR1R2R3, en el que R1 es -OCH2CH2, CN, R2 es -N (i-Pr) 2 y R3 es -OCH2CF3 y el compuesto con fórmula PR1R2R3, donde

R1 es -O-terc-butilo, R2 es -N (Et) 2, y R3 es – OCOCF3.

2. El compuesto de la reivindicación 1, donde R1 es -OCH3.

3. El compuesto de la reivindicación 1, donde R1 es -O-CH2CH=CH2.

4. El compuesto de la reivindicación 1, donde R1 es -OCH2CH2CN.

5. El compuesto de las reivindicaciones 1-4, donde R2 es halógeno.

6. El compuesto de las reivindicaciones 1-4, donde R2 se selecciona del grupo que incluye -N (Me) 2, -N (Et) 2, -N (Pr) 2, N (i-Pr) 2, 1-pirrolidnilo, 1-piperidinilo, 4-morfolinilo y 1-imidazolilo,

7. El compuesto de las reivindicaciones 1-4, donde R2 es -N (i-Pr) 2.

8. El compuesto de las reivindicaciones 1-7, donde R3 tiene la fórmula -O- (CH2) m (CF2) pCF3; m es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y p es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30.

9. Un compuesto de la reivindicación 8, donde m es 3 y p es 5.

10. Un compuesto de la reivindicación 8, donde m es 3 y p es 7.

11. Un método para la inhibición de la extensión de un oligonucleótido, y el método incluye la puesta en contacto de un oligonucleótido con un compuesto con o sin un catalizador, y dicho compuesto tiene la fórmula (I) :

PR1R2R3 (I) En el que R1 se selecciona a partir del grupo que consiste en alquiloxi C1-C8-, alqueniloxi C2-C8- y alquiniloxi C2-C8-, opcionalmente sustituido con CN;

R2 es un halógeno o -NR42; R3 tiene la fórmula – L-A; cada R4 es un alquilo C1-C6 o está combinado para formar un anillo heterocíclico de 4 a 7 miembros,

opcionalmente sustituido con 1-3 sustituyentes seleccionados a partir del grupo que consiste en alquilo C1-C6-, haloalquilo C1-C6-, alcoxi C1-C6 , arilalcoxi C1-C6-, oxo- y alcoxicarbonilo C1-C6; L es un alquilenoxi C1-C10-, que se sustituye opcionalmente con 1-3 sustituyentes seleccionados a partir del grupo que consiste en alquilo C1-C6 -, haloalquilo C1-C6-, alcoxi C1-C6-, arilalcoxi C1-C6-, oxo- y alcoxicarbonilo C1-C6-; y

A es un C1-C30perfluoroalquilo;

y donde un grupo alquilo hace referencia a una porción de hidrocarburo saturado lineal, ramificado o cíclico.

12. Un método para la preparación de un oligonucleótido modificado que incluye X nucleótidos donde X es un número entero mayor que 3; y el método incluye

(a) la puesta en contacto de varios oligonucleótidos, y cada uno incluye X-n unidades de nucleótido, con un nucleótido o nucleósido modificados, donde n es un número entero de 1 a X-1; y

(b) la puesta en contacto del producto no reaccionado de (a) con un reactivo protector que incluye un compuesto con la fórmula (I) :

PR1R2R3 (I) En el que R1 se selecciona a partir del grupo que consiste en C1-C8alquiloxi-, C2-C8alqueniloxi- y C2-C8alquiniloxi-, opcionalmente sustituido con CN;

R2 es un halógeno o NR42; R3 tiene la fórmula – L-A; cada R4 es un alquilo C1-C6 o está combinado para formar un anillo heterocíclico de 4 a 7 miembros,

opcionalmente sustituido con 1-3 sustituyentes seleccionados a partir del grupo que consiste en alquilo C1-C6-,

haloalquilo C1-C6-, alcoxi C1-C6 , arilalcoxi C1-C6-, oxo- y alcoxicarbonilo C1-C6; L es un alquilenoxi C1-C10-, que se sustituye opcionalmente con 1-3 sustituyentes seleccionados a partir del grupo que consiste en alquilo C1-C6 -, haloalquilo C1-C6-, alcoxi C1-C6-, arilalcoxi C1-C6-, oxo- y alcoxicarbonilo C1-C6-; y

A es un perfluoroalquilo C1-C30; y en el que un grupo alquilo hace referencia a una porción de hidrocarburo saturado lineal, ramificado o cíclico.

13. Una composición que incluye, al menos, un compuesto de las reivindicaciones 1-10.

14. Un kit para la preparación de un ácido nucleico, que incluye, al menos, un compuesto de las reivindicaciones 1-10 y, al menos, un monómero extensible; y opcionalmente también incluye, al menos, uno de (a) , al menos un soporte sólido; (b) al menos un catalizador para su utilización en al extensión del oligonucleótido; (c) al menos un tampón; y (d) al menos un contenedor para empaquetar los componentes del kit.