Composiciones de liberación inmediata para el tratamiento de daños tisulares.

Una composición para su uso en el tratamiento de un trastorno caracterizado por un daño tisular,

composiciónque comprende PEG unido a fibrinógeno desnaturalizado y que está formulada para la liberación inmediata de unproducto de escisión enzimática de dicho fibrinógeno desnaturalizado, comprendiendo dicho producto actividadterapéutica, en la que dicha liberación inmediata se efectúa mediante el uso de una formulación no reticulada, esdecir, no sometida a una reacción de polimerización de radicales libres, que tiene una proporción molar dePEG:fibrinógeno desnaturalizado de 2:1-350:1.

Composiciones de liberación inmediata para el tratamiento de daños tisulares

Campo y antecedentes de la invención La presente invención se refiere a composiciones según lo definido en las reivindicaciones para el tratamiento de trastornos asociados con el daño tisular.

Más detalladamente, la presente invención se refiere a una composición para su uso en el tratamiento de un trastorno caracterizado por un daño tisular, composición que comprende PEG unido a fibrinógeno desnaturalizado y que está formulada para la liberación inmediata de un producto de escisión enzimática de dicho fibrinógeno desnaturalizado, comprendiendo dicho producto actividad terapéutica, en la que dicha liberación inmediata se efectúa usando una formulación no reticulada, es decir, no sometida a una reacción de polimerización de radicales libres, que tiene una proporción molar de PEG:fibrinógeno desnaturalizado de 2:1 a 350:1. La composición está formulada preferentemente para la administración local o sistémica. La enzima se selecciona preferentemente del grupo que consiste en plasmina, colagenasa y tripsina. El producto de escisión enzimática es preferentemente como el expuesto en la SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8. El PEG se selecciona preferentemente del grupo que consiste en acrilato de PEG (PEG-Ac) y vinilsulfona de PEG (PEG-VS) . El PEG-Ac se selecciona preferentemente del grupo que consiste en PEG-DA, multiacrilato de PEG en estrella de 4 brazos y multiacrilato de PEG en estrella de 8 brazos. El PEG-DA es preferentemente un PEG-DA de 4 kDa, PEG-DA de 6 kDa, PEG-DA de 10 kDa y/o PEG-DA de 20 kDa.

La ingeniería tisular, es decir, la generación in vitro de nuevos tejidos vivos, se usa ampliamente para remplazar tejidos enfermos, traumatizados y otros tejidos no sanos. La estrategia clásica de la ingeniería tisular utiliza células vivas y un armazón básico para el cultivo celular (Langer y Vacanti, 1993; Nerem y Seliktar, 2001) . Por lo tanto, la estructura de armazón intenta imitar la estructura natural del tejido que se está reemplazando y proporcionar un soporte funcional temporal para las células (Griffith L. G., 2002) .

Los armazones de ingeniería tisular se fabrican o bien a partir de materiales biológicos o de polímeros sintéticos. Los polímeros sintéticos tales como polietilenglicol (PEG) , hidroxiapatita/policaprolactona (HA/PLC) , ácido poliglicólico (PGA) , ácido poli-L-láctico (PLLA) , polimetilmetacrilato (PMMA) , polihidroxialcanoato (PHA) , poli-4-hidroxibutirato (P4HB) , polipropilenfumarato (PPF) , dimetacrilato de polietilenglicol (PEG-DMA) , fosfato beta-tricálcico (beta-TCP) y politetrafluoroetileno (PTFE) no biodegradable proporcionan un control preciso sobre las propiedades físicas del material (Drur y y Mooney, 2003) .

Los métodos comunes de fabricación de armazones están basados en espumas de polímeros sintéticos. Sin embargo, la migración celular en el interior de los armazones sintéticos está limitada por la ausencia de oxígeno y el suministro de nutrientes. Para superar dichas limitaciones, se han desarrollado nuevas estrategias que utilizan fabricaciones sólidas de forma libre y arquitectura vascular interna (Revisado en Sachlos E. y Czernuszka J. T., 2003; Eur. Cell Mater. 5: 29-39) . Asimismo, también se emplean métodos de liofilización para crear estructuras tridimensionales únicas con distinta porosidad y permeabilidad. Sin embargo, la creación de poros en estos materiales es un procedimiento agresivo que implica el uso de condiciones tóxicas que eliminan la posibilidad de moldear previamente las construcciones tisulares con células vivas. Por lo tanto, muchos de los materiales prefabricados están sometidos a una siembra de células no uniforme y a poblaciones de células no homogéneas 45 dentro de las construcciones. Además, generalmente, los materiales se degradan desigualmente durante el proceso de cultivo tisular, creando un tejido muy anisotrópico con una cinética de crecimiento modificada.

Los armazones fabricados con PEG son muy biocompatibles (Merrill y Salzman, 1983) y presentan características físicas versátiles basándose en su porcentaje en peso, longitud de la cadena molecular y densidad de reticulación (Temenoff J. S. et al., 2002) . Además, los hidrogeles de PEG pueden tener una transición controlada de líquido a sólido (gelificación) en presencia de suspensión celular (Elbert y Hubbell, 2001) . Por otra parte, la reacción de gelificación del PEG (es decir, PEGilación) se puede llevar a cabo en condiciones no tóxicas en presencia de un fotoiniciador (Elisseeff J. et al., 2000; Nguyen y West, 2002) o mezclando una solución reactiva bifásica de PEG funcionalizado y reticulando los constituyentes (Lutolf y Hubbell, 2003) .

Sin embargo, aunque los polímeros sintéticos anteriormente mencionados permiten un control preciso sobre el material de armazón, a menudo ofrecen información biológica inadecuada para el cultivo celular. Como resultado de ello, estos materiales no son adecuados para el cultivo tisular a largo plazo o para la regeneración tisular in vivo.

Por otro lado, los armazones de origen natural tales como colágeno, fibrina, alginato, ácido hialurónico, gelatina y celulosa bacteriana (CB) proporcionan señales biofuncionales y presentan diversas interacciones celular. Por ejemplo, la fibrina, un sustrato natural de remodelación tisular (Herrick S., et al., 1999) , contiene diversos dominios de señalización celular tales como un sustrato de degradación por proteasas (Werb Z., 1999) y dominios de adhesión celular (Herrick S., 1999) . Sin embargo, debido a que dichos materiales biológicos presentan múltiples 65 señales intrínsecas (por ejemplo, regulación de la adhesión celular, proliferación, fenotipo celular, producción de matriz y actividad enzimática) , su uso como armazones en la regeneración tisular a menudo produce una regulación anómala de los sucesos celulares (Hubbell, 2003) . Además, los armazones naturales suelen ser mucho más débiles tras la reconstitución en comparación con la resistencia del material biológico original, y se puede ejercerse un escaso control para mejorar sus propiedades físicas.

Otro inconveniente de los armazones naturales (por ejemplo, colágeno y fibrina) para la modificación por ingeniería genética de tejidos es el control limitado sobre las propiedades físicas de la red polimérica. Por ejemplo, el colágeno reconstituido sufre fibrilogénesis y auto-ensamblaje para formar una red interpenetrante de fibrillas a escala nanométrica que se asocian libremente entre sí mediante interacciones inespecíficas, tales como enlaces de hidrógeno. En comparación con las fibras de colágeno altamente organizadas y reticuladas enzimáticamente de la estructura del tejido normal, la red interpenetrante de las fibrillas presenta una baja resistencia física y porosidad tisular súper-fisiológica. Por otra parte, la configuración específica de las fibrillas combinada con la estructura de poros abiertos de la red interpenetrante deja la estructura de la proteína fácilmente accesible y susceptible a las proteasas de libre difusión del tejido huésped circundante o sistema de cultivo celular. Esto a menudo produce el deterioro incontrolado y prematuro del armazón en presencia de proteasas secretadas por las células. Las discrepancias en la estructura y función de los hidrogeles proteicos reconstituidos en comparación con los naturales instan al desarrollo de sistemas de armazón biomiméticos para su implementación en muchas aplicaciones prácticas de ingeniería tisular.

Hasta la fecha, se ha desarrollado una serie de técnicas para la modificación y mejora de las propiedades fisicoquímicas de los hidrogeles proteicos reconstituidos que les impiden una rápida degradación. Los hidrogeles de colágeno y fibrina se pueden procesar mediante la liofilización de la construcción para aumentar la resistencia a la tracción y el módulo de tracción de la red proteica. Sin embargo, la liofilización requiere una etapa de congelación previa a la fabricación que elimina la posibilidad de gelificar el polímero en presencia de células y también elimina los beneficios de la polimerización in situ. El proceso de liofilización también afecta a la arquitectura molecular de la red 25 polimérica, alterando la malla de nano-fibras y convirtiéndola en una estructura de esponja macro-porosa. Se han propuesto otras técnicas para mejorar las propiedades físicas de los hidrogeles naturales, manteniendo a la vez la estructura de nano-fibras basándose en las reticulaciones covalentes, incluyendo el uso de aldehídos, carbodiimidas [Park S. N., Park J. C., Kim H. O., Song M. J., Suh H. “Characterization of porous collagen/hyaluronic acid scaffold modified... [Seguir leyendo]

1. Una composición para su uso en el tratamiento de un trastorno caracterizado por un daño tisular, composición que comprende PEG unido a fibrinógeno desnaturalizado y que está formulada para la liberación inmediata de un producto de escisión enzimática de dicho fibrinógeno desnaturalizado, comprendiendo dicho producto actividad terapéutica, en la que dicha liberación inmediata se efectúa mediante el uso de una formulación no reticulada, es decir, no sometida a una reacción de polimerización de radicales libres, que tiene una proporción molar de PEG:fibrinógeno desnaturalizado de 2:1-350:1.

2. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición está formulada para la administración local.

3. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición está formulada para la administración sistémica. 15

4. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha enzima está seleccionada del grupo que consiste en plasmina, colagenasa y tripsina.

5. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho producto de escisión enzimática 20 es como se expone en SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u8.

6. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho PEG está seleccionado del grupo que consiste en acrilato de PEG (PEG-Ac) y vinilsulfona de PEG (PEG-VS) .

7. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en la que dicho PEG-Ac está seleccionado del grupo que consiste en PEG-DA, multiacrilato de PEG en estrella de 4 brazos y multiacrilato de PEG en estrella de 8 brazos.

8. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en la que dicho PEG-DA es un PEG-DA de 4 kDa, 30 PEG-DA de 6 kDa, PEG-DA de 10 kDa y/o PEG-DA de 20 kDa.