Composición de Bacillus resistente a la bilis que secreta altos niveles de aminoácidos esenciales.

Composición de Bacillus, que comprende de 105 a 1012 CFU/g de células de espora de Bacillus,

donde lacomposición de Bacillus se caracteriza por el hecho de que:

(i): las esporas de Bacillus tienen una germinación y un crecimiento rápidos de espora a célula vegetativa enpresencia de un medio de sal de bilis que comprende 4 mM de sales de bilis y en presencia de un medio de salde bilis que comprende 6 mM de sales de bilis, definido por el hecho de que las esporas de Bacillus alcanzanun punto de crecimiento de célula vegetativa de 0,4 OD630 en menos de 18 y 19 horas, respectivamente, dondeel punto de crecimiento de célula vegetativa es el punto en la curva de crecimiento en el que el valor ODcomienza a aumentar (debido al crecimiento de las células vegetativas) de manera continua y alcanza un OD630de 0,4;

(I): donde el medio de sal de bilis es el medio de caldo de infusión de ternera (VIB) no selectivosuplementado con una mezcla de sal de bilis que comprende las sales de bilis conjugadastaurodesoxicolato y glicodeoxicolato y la sal de bilis desconjugada deoxicolato en las proporciones60% de taurodesoxicolato, 30% de glicodeoxicolato y 10% de deoxicolato; y

donde el análisis de ensayo OD se realiza mediante los siguientes pasos:

(a): rellenando un pocillo de una placa de microtitulación con 0,150 ml de medio de sal de biliscon 108 esporas de Bacillus por ml de medio (es decir, este es el tiempo cero); e

(b): incubando la placa a 37°C bajo condiciones atmosféricas y midiendo los valores OD630,

usando un espectrofotómetro y con agitación antes de cada lectura, para obtener una curva decrecimiento representativa en el tiempo;

y

(ii) las células vegetativas de Bacillus producen al menos un aminoácido esencial en una cantidad que es almenos 2 veces más que la de la célula de Bacillus de referencia DSM 19467, donde la cantidad de aminoácidoesencial producido se mide en el sobrenadante mediante el ensayo basado en aminoácido del métodoestándar GC-MS para muestras acuosas usando cloroformato de metilo como agente de derivatizacióndespués de dos días de crecimiento de las células de Bacillus a 37°C y 150 r.p.m., incubadas en tubos con 10ml de medio de un medio de crecimiento de sales mínimo con la siguiente composición:

(NH4)2SO4 (Merck 1:01217.1000) 1 g/l

K2HPO4 (Merck 1.05101.1000) 7 g/l

KH2PO4 (Merck 1.04873.1000) 3 g/l

MgSO4·7H2O (Merck 1.05886.1000) 0,1 g/l

que se ha sometido a autoclave durante 15 min a 121°C y se ha añadido glucosa sometida a autoclave en unaconcentración final de 0,5 %.

Composición de Bacillus resistente a la bilis que secreta altos niveles de aminoácidos esenciales Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere a una composición de Bacillus caracterizada por una germinación y crecimiento rápidos en las sales de bilis (entorno intestinal simulado) y por una secreción de alto nivel de aminoácidos esenciales. La composición de Bacillus se puede utilizar como suplemento en alimentos para animales, donde tiene un efecto probiótico (estimulando la salud y el crecimiento) y aumenta la digestión y la disponibilidad de nutrientes a partir de los alimentos para animales.

Estado de la técnica

Bacterias probióticas tales como Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis se usan en la industria del alimento para animales como suplemento para la dieta. Su uso se refiere a la capacidad del Bacillus para reemplazar o reducir el uso de antibióticos, que se usan como estimuladores del crecimiento en la industria del alimento para animales.

Christian Hansen A/S, Dinamarca, comercializa un ejemplo de tal producto estimulante del crecimiento probiótico ®®

bajo el nombre comercial GalliPro (depositado para propósitos de patente como DSM 17231) . GalliPro es una composición de células de esporas de Bacillus subtilis.

Además del modo sugerido de acciones (p. ej. modulación inmunológica, modificador de flora intestinal) , los Bacillus probióticos son capaces de producir muchos componentes beneficiosos, tales como enzimas, que se excretan en el tracto gastro intestinal (GIT) cuando se usan como suplemento de alimento para animales. Enzimas tales como fitasa se excretan y mejoran la digestión y la asimilación del alimento para animales (mayor digestibilidad) . La dieta (alimento) está compuesta, principalmente, por elementos de origen vegetal tales como granos, maíz, semilla de soja, aceite de soja y aminoácidos. En general, estos efectos contribuyen a la producción de productos para animales rentables.

Los Bacillus probióticos también son capaces de producir otros componentes beneficiosos tales como aminoácidos esenciales.

Las esporas de Bacillus pueden pasar la barrera ácida gástrica y germinar y crecer dentro del tracto gastrointestinal (GIT) de los animales. Esto tiene grandes ventajas, dado que cuando se ingieren pueden excretar numerosos tipos de componentes beneficiosos, por ejemplo bacteriocinas, y también excretan aminoácidos esenciales útiles. Por otra parte, las esporas de Bacillus son termoestables durante un proceso de paletización del alimento y de este modo son un excelente sistema de entrega para obtener tanto bacteriocinas como, por ejemplo, aminoácidos esenciales en el GIT.

En el proceso de supervivencia y proliferación de Bacillus en el GIT, la función de la bilis es importante. La bilis se produce en el hígado y se almacenada en la vesícula biliar. La bilis contiene agua, lecitina, bilirrubina y biliverdina y sales de bilis.

Se conoce por la bibliografía que la bilis tiene algunas influencias negativas en la supervivencia y germinación y crecimiento de células de espora de Bacillus a células vegetativas en el GIT de los animales. Por lo tanto, se está investigando para encontrar cepas de Bacillus resistentes a la bilis probiótica.

El artículo (Antonie Van Leeuwehhoek. 2006 Aug; 90 (2) : 139-46. Epub 2006 Jul 4) describe el aislamiento de un número de muestras/células de Bacillus directamente del intestino de pollos. Las células de Bacillus aisladas se evaluaron para actividad probiótica. Los seis bacilos con la actividad probiótica más alta se evaluaron para resistencia a la sal de bilis y se descubrió que un Bacillus específico altamente probiótico tiene un nivel relativamente alto de resistencia a la sal de bilis. En este artículo no hay un enfoque especial sobre cualquier período de tiempo para la prueba de resistencia a la bilis. En la parte experimental, las células de espora de Bacillus simplemente se evalúan para resistencia después de 5 días de presencia en la sal de bilis (véase el párrafo "Simulated small intestinal fluid tolerance test" en la página 141) .

La US2003/0124104A describe que las endoesporas de Bacillus probiótico convencional son sensibles a la baja concentración de sales de bilis, es decir, la germinación y/o rehidratación de la espora se inhibe por la presencia de concentraciones incluso bajas de sales de bilis. Esto es lo contrario de otras bacterias tales como los patógenos entéricos, tales como E. coli o S. aureus (véase la sección [0014] a [0015]) . Visto esto, se sugiere filtrar/seleccionar para esporas de Bacillus que sean resistentes a la actividad inhibidora de las sales de bilis y, como resultado, germinen en células vegetativas, que después colonizan el colon (véase [0019]) . Los ejemplos prácticos están todos presentes y no se aportan datos experimentales reales de células de Bacillus específicas seleccionadas en la descripción. Además, las condiciones de selección de la sal de bilis se describen de manera relativamente genérica. En particular, no se indican períodos de tiempo para las selecciones de la resistencia a la bilis. Dicho en otras palabras, basado en el enseñanza únicamente amplia/genérica de este documento, se pueden seleccionar células de Bacillus que sólo pueden crecer (germinar) lentamente, es decir, que son capaces de germinar a partir de esporas a células vegetativas después de, por

ejemplo, 20 horas en presencia de una cantidad importante de sal de bilis.

En este documento no hay una descripción o sugerencia para seleccionar células de Bacillus que puedan crecer (germinar) rápidamente, es decir, capaces de germinar y crecer a partir de esporas a células vegetativas que alcancen un punto de crecimiento definido dentro de un determinado intervalo de tiempo en presencia de una cantidad importante de sal de bilis.

En resumen, las referencias de la técnica anterior acerca de la selección/filtrado de células de Bacillus resistentes a la bilis no se centran en el rápido crecimiento/germinación a partir de células de esporas a células de Bacillus vegetativas.

La solicitud internacional PCT, con número de solicitud PCT/EP2008/057296 se solicitó el 11/06/2008. El solicitante es Chr. Hansen A/S y NO ESTABA PUBLICADA en la fecha de depósito de la presente solicitud.

La PCT/EP2008/057296 describe esporas de Bacillus nuevas caracterizadas por tener una velocidad

mejorada/rápida de germinación y crecimiento a partir de esporas a célula vegetativa en presencia de un medio de sal de bilis. Las esporas de Bacillus, como se describen en este caso, tienen la misma velocidad mejorada/rápida de germinación y crecimiento a partir de espora a célula vegetativa según se describe en la PCT/EP2008/057296.

La PCT/EP2008/057296 sólo describe células vegetativas de Bacillus que producen fitasa en una cantidad

aumentada en comparación con la célula de Bacillus de referencia DSM 19467. NO se describe ni se sugiere buscar una célula vegetativa de Bacillus que produzca aminoácidos esenciales en una cantidad aumentada en comparación con la célula de Bacillus de referencia DSM 19467.

Cuando más adelante se hace referencia al estado de la técnica, se debe entender como el estado de la técnica 30 disponible al público (p. ej. artículos/patentes publicados) en la fecha de depósito de la presente solicitud.

Resumen de la invención [0017] El problema que debe resolver la presente invención es proporcionar una composición de Bacillus que excrete 35 cantidades altas de aminoácidos esenciales en el tracto gastrointestinal (GIT) de un animal.

La solución se basa en que los presentes inventores han desarrollado un método de selección nuevo para identificar composiciones de Bacillus mejoradas nuevas. Un paso nuevo importante del nuevo método de selección descrito en la presente es la filtración/selección específica de células de espora de Bacillus con velocidad

mejorada/rápida de germinación y crecimiento de esporas a células vegetativas en presencia de sales de bilis.

Como se ha descrito anteriormente, el estado de la técnica ha descrito métodos para seleccionar células de Bacillus capaces de crecer en presencia de sales de bilis, pero los métodos de filtración/selección del estado de la técnica no se centran en la velocidad de germinación y crecimiento en presencia de sal de bilis. Por consiguiente, las 45 células de Bacillus resistentes a la bilis seleccionadas por la técnica anterior no germinan ni crecen suficientemente rápido para cumplir los criterios de velocidad de germinación y crecimiento según se describe en este caso. Por ejemplo, células de Bacillus aisladas directamente... [Seguir leyendo]

1. Composición de Bacillus, que comprende de 10 a 10 CFU/g de células de espora de Bacillus, donde la composición de Bacillus se caracteriza por el hecho de que:

(i) : las esporas de Bacillus tienen una germinación y un crecimiento rápidos de espora a célula vegetativa en presencia de un medio de sal de bilis que comprende 4 mM de sales de bilis y en presencia de un medio de sal de bilis que comprende 6 mM de sales de bilis, definido por el hecho de que las esporas de Bacillus alcanzan un punto de crecimiento de célula vegetativa de 0, 4 OD630 en menos de 18 y 19 horas, respectivamente, donde el punto de crecimiento de célula vegetativa es el punto en la curva de crecimiento en el que el valor OD comienza a aumentar (debido al crecimiento de las células vegetativas) de manera continua y alcanza un OD630 de 0, 4;

(I) : donde el medio de sal de bilis es el medio de caldo de infusión de ternera (VIB) no selectivo suplementado con una mezcla de sal de bilis que comprende las sales de bilis conjugadas taurodesoxicolato y glicodeoxicolato y la sal de bilis desconjugada deoxicolato en las proporciones 60% de taurodesoxicolato, 30% de glicodeoxicolato y 10% de deoxicolato; y

donde el análisis de ensayo OD se realiza mediante los siguientes pasos:

(a) : rellenando un pocillo de una placa de microtitulación con 0, 150 ml de medio de sal de bilis con 10 esporas de Bacillus por ml de medio (es decir, este es el tiempo cero) ; e (b) : incubando la placa a 37°C bajo condiciones atmosféricas y midiendo los valores OD630, usando un espectrofotómetro y con agitación antes de cada lectura, para obtener una curva de crecimiento representativa en el tiempo;

y

(ii) las células vegetativas de Bacillus producen al menos un aminoácido esencial en una cantidad que es al menos 2 veces más que la de la célula de Bacillus de referencia DSM 19467, donde la cantidad de aminoácido esencial producido se mide en el sobrenadante mediante el ensayo basado en aminoácido del método estándar GC-MS para muestras acuosas usando cloroformato de metilo como agente de derivatización después de dos días de crecimiento de las células de Bacillus a 37°C y 150 r.p.m., incubadas en tubos con 10 ml de medio de un medio de crecimiento de sales mínimo con la siguiente composición:

(NH4) 2SO4 (Merck 1:01217.1000) 1 g/l K2HPO4 (Merck 1.05101.1000) 7 g/l KH2PO4 (Merck 1.04873.1000) 3 g/l MgSO4·7H2O (Merck 1.05886.1000) 0, 1 g/l

que se ha sometido a autoclave durante 15 min a 121°C y se ha añadido glucosa sometida a autoclave en una concentración final de 0, 5 %.

2. Composición de Bacillus de la reivindicación 1, donde las células de esporas de Bacillus de la composición están presentes como células de espora en forma seca (p. ej. secado por pulverización) .

3. Composición de Bacillus de las reivindicaciones 1 o 2, donde la célula de Bacillus es una célula de B. subtilis.

4. Composición de Bacillus de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde las esporas de Bacillus alcanzan el punto de crecimiento de célula vegetativa al menos 3 horas antes que las células de esporas de Bacillus subtilis de referencia depositadas como DSM 17231, que bajo las condiciones del punto (i) según la reivindicación 1 es al menos 20 horas después de la incubación.

5. Composición de Bacillus de cualquiera de reivindicaciones 1 a 4, donde el aminoácido esencial es un aminoácido esencial seleccionado del grupo que consiste en: fenilalanina, valina, treonina, triptófano, isoleucina, metionina, leucina, lisina, cisteína, tirosina, histidina y arginina.

6. Composición de Bacillus de la reivindicación 5, donde el aminoácido esencial es al menos un aminoácido esencial seleccionado del grupo que consiste en: valina, isoleucina y leucina.

7. Composición de Bacillus de la reivindicación 6, donde el aminoácido esencial es leucina.

8. Composición de Bacillus de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde las células vegetativas de Bacillus producen al menos un aminoácido esencial en una cantidad al menos 4 veces superior a la de la célula de Bacillus de referencia DSM 19467 bajo las condiciones del punto (ii) de la reivindicación 1.

9. Método para alimentar a un animal que comprende la administración de la composición de Bacillus de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 a un animal conjuntamente con otros ingredientes de alimento para animales.

10. Método para alimentar a un animal según la reivindicación 9, donde el animal es un animal seleccionado del grupo que consiste en aves, rumiantes, terneros, cerdos, conejos, caballos, peces y animales domésticos.

11. Método para seleccionar y aislar una célula de Bacillus nueva que comprende los pasos siguientes:

(a) : selección y aislamiento, a partir de una agrupación de células de esporas de Bacillus individuales, de una nueva célula de espora de Bacillus que es capaz de germinar y de crecer tan rápidamente que alcanza un punto de crecimiento de célula vegetativa en menos de 18 y 19 horas bajo las condiciones del punto (i) de la reivindicación 1; (b) : producción de una célula de Bacillus vegetativa a partir de la célula de espora aislada del paso (a) y

mutación de la célula aislada y seleccionada nueva para obtener una agrupación de células vegetativas de Bacillus individuales nuevas; (c) : selección y aislamiento, a partir de la agrupación de células vegetativas de Bacillus individuales nuevas del paso (b) , de una nueva célula vegetativa de Bacillus que es capaz de producir al menos un aminoácido esencial en una cantidad que es superior a la de la célula de Bacillus de referencia DSM 19467 bajo las condiciones del punto (ii) de la reivindicación 1 y (d) : análisis de la célula de Bacillus vegetativa de alta producción del paso (c) para confirmar que ésta ha mantenido la germinación y el crecimiento rápidos del paso (a) y aislamiento de la célula de Bacillus seleccionada.

12. Método para seleccionar y aislar una célula de Bacillus nueva según la reivindicación 11, donde la célula de Bacillus es una célula de B. subtilis.