Biomarcadores polipéptidos para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer.

Un péptido que consiste en la secuencia de SEC ID Nº: 17.

Biomarcadores polipéptidos para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer

Campo de la invención La invención pertenece al campo de los diagnósticos. Más específicamente, la invención pertenece al campo de evaluación del estado de la enfermedad de Alzheimer en sujetos mediante la detección de polipéptidos marcadores específicos de la enfermedad de Alzheimer.

Antecedentes de la invención Enfermedad de Alzheimer

La enfermedad de Alzheimer es una forma crecientemente prevalente de neurodegeneración que da cuenta de aproximadamente el 50-60 % de los casos generales de demencia entre la gente por encima de los 65 años de edad. Patológicamente, la neurodegeneración de la enfermedad de Alzheimer se caracteriza por atrofia prominente de estructuras corticolímbicas con muerte neuronal y pérdida de sinapsis neuronales, formación de marañas neurofibrilares, (NFT) y la formación de placas seniles que contienen depósitos de agregados de ß1-42 amiloide (Aß42) en el cerebro [Francis PT 1999]. La duración del declive cognitivo progresivo es aproximadamente 7 años desde la aparición de los primeros signos hasta la muerte. Se asume que la fase clínica está precedida por un periodo preclínico de 15-30 años de deposición continua de placas amiloides y marañas neurofibrilares. La edad de aparición y la progresión de la enfermedad están grandemente determinadas por las mutaciones de los genes causantes y por factores genéticos de susceptibilidad. Se pueden añadir varios factores de riesgo ambientales a los factores de riesgo genéticos individuales. Los factores genéticos conocidos por estar implicados en la forma familiar de enfermedad de Alzheimer con aparición temprana de la enfermedad son: mutaciones en genes de presenilina I (PS1) , presenilina 2 (PS2) y proteína precursora amiloide (APP) y la presencia del alelo E4 de la apolipoproteína E4. Sin embargo, la mayoría (95 %) de los casos de enfermedad de Alzheimer son esporádicos y heterogéneos.

Actualmente, el diagnóstico clínico de la enfermedad de Alzheimer solo puede establecerse en fases más tardías de la enfermedad, cuando la actuación cognitiva está significativamente disminuida por alteraciones estructurales del cerebro. El tratamiento diagnóstico clínico requiere un historial medico cuidadoso; examen físico y neurológico; exámenes de sangre, orina y líquido cefalorraquídeo (LCR) para excluir estados morbosos metabólicos y médicos que puedan pasar por enfermedad de Alzheimer; exámenes psicométricos detallados para valorar el estado mental y la actuación cognitiva y técnicas de formación de imágenes tales como formación de imágenes de exploración tomográfica computerizada o formación de imágenes de resonancia magnética del cerebro. Las evaluaciones diagnósticas en centros de expertos alcanzan una seguridad de aproximadamente el 80-85 %.

Debido al hecho de que estas pruebas son caras y llevan mucho tiempo y son particularmente incómodas para los pacientes, existe la necesidad creciente de marcadores biomoleculares diagnósticos específicos fácilmente accesibles, que puedan medirse en fluidos corporales, tales como LCR, sangre u orina y que tengan un valor predictivo positivo alto para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer, o que ayudarían a distinguir la enfermedad de Alzheimer de otras formas de demencia. Además, los marcadores fiables sensibles a la progresión de la enfermedad pueden constituir parámetros sustitutos, un prerrequisito principal para la evaluación y el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas orientadas a las causas y modificadoras de la enfermedad en la enfermedad de Alzheimer.

Dado que el LCR rodea directamente el cerebro, los cambios en su composición proteica pueden reflejar con la mayor seguridad afecciones patológicas que están asociadas con alteraciones específicas de los patrones de expresión proteicos. Durante la última década, se ha comunicado un número de anormalidades biológicas en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes de enfermedad de Alzheimer, en particular niveles alterados del fragmento Aß142 de la proteína precursora amiloide y niveles alterados de la proteína tau hiperfosforilada. La sensibilidad y especificidad de estos marcadores, sin embargo, es baja o solo modesta [The Ronald and Nancy Reagan Research Institute of the Alzheimer’s Association y el National Institute on Aging Working Group, 1998, Robles A 1998, Teunissen CE y col., 2002].

Así, existe la necesidad de biomarcadores novedosos con suficiente sensibilidad y especificidad para (i) detectar enfermedad de Alzheimer tan pronto como sea posible y (ii) permitir la diferenciación de la enfermedad de otros tipos de demencia o enfermedades neurodegenerativas y (iii) realizar seguimiento de eficacia terapéutica como parámetro sustituto, por ejemplo en desarrollo de fármacos clínicos e iniciar farmacoterapia tan pronto como sea posible y posponer pérdida de memoria y progresión de la enfermedad.

Tecnología de chip proteico Una tecnología de chip proteico llamada espectrometría de masas por desorción/ionización por matriz en superficie tiempo de vuelo (EM SELDI-TOF) se ha desarrollado recientemente para facilitar la elaboración de perfiles proteicos de mezclas biológicas completas [Davies HA 2000, Fung ET 2001, Merchant M 2000].

Varios grupos ya han usado la espectrometría de masas de chip de proteínas para detectar biomarcadores potencialmente novedosos de próstata y vejiga [Adam BL 2001] o cáncer de mama [Wulfkuhle JD 2001] en suero, plasma seminal, fluido del pezón, orina o extractos celulares. Para una revisión de la búsqueda de biomarcadores usando EM de SELDI-TOF, véase [Issaq HJ 2002].

Cistatina C

Descrita inicialmente en 1961 en el líquido cefalorraquídeo (LCR) , la cistatina C (traza de y-globulina o post-yglobulina, nº de acceso P01034) es un inhibidor de la cisteína proteinasa pequeño presente en todos los fluidos corporales humanos a concentraciones fisiológicamente relevantes. El papel fisiológico de cistatina C es probablemente regular actividad proteasa de cisteína extracelular, que resulta de invasión microbiana o de liberación de proteinasas lisosomales a partir de células moribundas o enfermas. La cistatina C colocaliza con ß-amiloide (Aß) en las paredes de las arteriolas en los cerebros de enfermedad de Alzheimer y de angiopatía amiloide cerebral [Levy E 2001]. Hay dos haplotipos comunes del gen CST3 que codifican para cistatina C (A y B) que difieren el uno del otro en tres sitios: dos cambios de pares de bases únicos en la región promotora y uno en el dominio de péptido señal que causan una sustitución de aminoácido (alanina a treonina) . Recientemente, los estudios control de casos encontraron asociaciones de CST3 con riesgo incrementado para enfermedad de Alzheimer de aparición tardía [Crawford FC 2000, Finckh U 2000, Beyer K 2001].

La hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis, tipo Islandés (HCHWA-I) , también llamada angiopatía amiloide de cistatina C hereditaria (HCCAA) , es una forma autosómica dominante de angiopatía amiloide cerebral (CAA) . El amiloide depositado en las paredes de los vasos del cerebro está compuesto principalmente de una variante de cistatina C caracterizada por la presencia de sustitución Leu68-GIn [Cohen 1983, Ghiso 1986]. Esta patología está acoplada también a una concentración disminuida de este inhibidor de proteinasa de cisteína principal en el líquido cefalorraquídeo y conduce a su deposición amiloide en el cerebro [Grubb AO 1984].

Leung-Tack y col. han purificado también dos isoformas truncadas N-terminales de cistatina C en orina a partir de un paciente quien había recibido transplante renal. De acuerdo con sus datos, la cistatina C (des1-4) tiene un efecto inhibidor sobre dos funciones de células mononucleares periféricas humanas (PMN) : liberación de O2 y fagocitosis, que pueden deberse a la secuencia N-terminal ’KPPR’. Sus datos respaldan un papel potencialmente importante para cistatina C como un posible inmunomodulador durante inflamación. La evidencia que se acumulan indican que el daño mediado por radicales libres incrementado a la función celular contribuye al proceso de envejecimiento y a los trastornos neurodegenerativos relacionados con la edad. El estrés oxidativo puede jugar un papel en la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica (ALS) . Aunque el daño de los radicales libres a neuronas puede no ser el evento principal que inicie estas enfermedades, parece que el daño de los radicales libres está implicado en la cascada patogenética de estos trastornos.

Beta-2-microglobulina La beta-2-microglobulina (nº de acceso P01884) constituye el componente constante pequeño... [Seguir leyendo]

1. Un péptido que consiste en la secuencia de SEC ID Nº: 17.

2. Un procedimiento de evaluar el estado de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto, que comprende la detección de un polipéptido que consiste en la secuencia de SEC ID Nº: 17 en una muestra de dicho sujeto.

3. Procedimiento de evaluar el estado de la enfermedad de Alzheimer según la reivindicación 2, en el que se detecta al menos un polipéptido adicional seleccionado del grupo que consiste en polipéptidos que comprende las SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº:4, SEC ID Nº:5, SEC ID Nº:6, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16 o seleccionado del grupo que consiste en cistatina C humana, beta-2-microglobulina humana, el homólogo de 7, 7 kD

de mioglobina humana, proteína VGF neurosecretora, un fragmento de al menos 5 aminoácidos de cistatina C humana, un fragmento de al menos 5 aminoácidos de beta-2-microglobulina humana, un fragmento de al menos 5 aminoácidos del homólogo de 7, 7 kD de mioglobina humana y se detecta un fragmento de al menos 5 aminoácidos de proteína VGF neurosecretora.

4. Procedimiento de investigación de la progresión de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto caracterizado porque se lleva a cabo un procedimiento de la reivindicación 2 o de la reivindicación 3 con al menos dos muestras distintas extraídas del mismo sujeto.

5. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que la detección de dicho (s) polipéptido (s) es por EM de SELDI-TOF.

6. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que anticuerpos específicos o anticuerpos que 20 reconocen dichos polipéptidos se usan para la detección de dicho (s) polipéptido (s) .

7. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que la detección es en una muestra que comprende LCR, sangre, suero, plasma, orina, plasma seminal, fluido del pezón, y/o extractos celulares de dicho paciente.

8. Un kit para evaluar el estado de la enfermedad de Alzheimer que comprende un polipéptido seleccionado del 25 grupo que consiste en la SEC ID Nº: 17.

Figura 1: