Biblioteca de Fab para la preparación de una mezcla de anticuerpos.

Un procedimiento para producir una mezcla que comprende al menos dos anticuerpos diferentes y/o dosfragmentos de anticuerpos diferentes,

en el que al menos dos anticuerpos y/o fragmentos comprenden regionesvariables emparejadas y diferentes especificidades de unión, comprendiendo dicho procedimiento

(a) poner en contacto al menos tres regiones variables diferentes derivadas de cadenas pesadas y cadenasligeras de inmunoglobulinas dentro de una célula en condiciones que permiten el emparejamiento de regionesvariables;

(i) en el que al menos una de dichas regiones variables es una región variable de cadena ligeracompatible de emparejamiento; y

(ii) en el que se influye sobre la composición de la mezcla manipulando uno cualquiera de los parámetrosque afectan el nivel de expresión de las regiones variables logrado en la célula; y

(b) cosechar todos los anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpos que tienen especificidades de uniónresultantes del citado emparejamiento.

Biblioteca de Fab para la preparación de una mezcla de anticuerpos La presente invención se refiere al campo de la biología molecular, en particular a la biología molecular médica. El reconocimiento específico desempeña un papel importante en la biología médica moderna. Las interacciones 5 receptor-ligando, respuestas inmunes, infecciones, conversiones enzimáticas se basan todas en el reconocimiento específico entre moléculas. De particular interés son las interacciones específicas proteína-proteína, que dan una amplia selección de posibilidades para interferir en todas las clases de procesos biológicos. A lo largo de los procesos naturales biológicos se encuentra que dependen de más de una interacción proteica (simultánea) . En el momento presente parece que intervenir en más de un punto en un proceso biológico va a ser más efectivo que una interferencia 10 individual. Particularmente en la terapia de anticuerpos se ve que un anticuerpo (monoclonal) a menudo no es suficientemente efectivo para tratar un trastorno y/o enfermedad particular. Por lo tanto la atención de muchos investigadores médicos se centra ahora en terapias de combinación. Ejemplos bien conocidos de combinaciones de anticuerpos que se persiguen clínicamente actualmente son para el tratamiento de linfoma no de Hodgkin, la combinación del ya aprobado anticuerpo anti-CD20 Rituxán con el anticuerpo anti-CD22 Epratuzumab de AmGen y 15 para el tratamiento de hepatitis B, una combinación de dos anticuerpos humanos que se desarrollan por XTL Pharmaceuticals (Galun E. y cols., Hepatology (2002) 35: 673-679) . Sin embargo, la combinación de múltiples (dos o más) fármacos (sean anticuerpos u otros) tiene varios inconvenientes, técnicos, prácticos y reguladores. Los fármacos no se diseñaron como combinaciones y desarrollo con eficacia clínica óptima y la compatibilidad puede ser un problema. Como un ejemplo, las condiciones para estabilizar una pueden ser perjudiciales para la estabilidad de la (s)

otra (s) . Además, fuentes múltiples de producción recombinante conducen a fuentes múltiples de riesgos tales como contaminación vírica, contaminación anterior y similares.

El documento US 5.667.988 describe procedimientos para mutagénesis en una región recombinante complementaria (CDR) de un gen de cadena ligera de inmunoglobulina para el propósitos de producir bibliotecas de genes de cadena ligera para usar en combinación con genes de cadena pesada y bibliotecas de genes para producir bibliotecas de anticuerpos.

Burioni y cols., Virology 228, 29-35 (2001) revelan la identificación de Fab humanos que unen la glucoproteína E2 del virus de la hepatitis C. Los Fab individuales se generaron en bacterias y se probaron en experimentos de ELISA.

Chen y cols., J. Mol. Biol. (1999) 293, 865-881 describen un anticuerpo anti-VEGF optimizado que se ha obtenido por maduración de afinidad de la parte de Fav de un anticuerpo VEGF humanizado (Fab-12; forma de IgG conocida como rhuMAb VEGF) , por mutación de región determinante complementaria seguida por selección de afinidad usando presentación de fago monovalente.

El documento WO 2004/009618 describe procedimientos para la producción de mezclas de anticuerpos en los que se expresan secuencias de ácidos nucleicos que codifican cadenas pesadas y al menos una cadena ligera en un huésped recombinante.

La presente invención proporciona combinaciones de proteínas de unión específicas, tales como inmunoglobulinas, que se diseñan para ser combinaciones verdaderas, siendo funcionales y compatibles entre sí esencialmente todos los componentes de la combinación. Produciendo combinaciones verdaderas los autores de la presente invención han abierto una vía de mejoras tanto en la producción como en las propiedades de las combinaciones. Estas mejoras y sus ventajas serán patentes a partir de la siguiente descripción.

La invención proporciona un procedimiento para producir una mezcla que comprende al menos dos anticuerpos diferentes y/o fragmentos de anticuerpo, en los que dichos al menos dos anticuerpos y/o fragmentos comprenden regiones variables emparejadas y tienen diferentes especificidades de unión, comprendiendo dicho procedimiento (a) poner en contacto al menos tres regiones variables diferentes derivadas de cadenas pesadas y cadenas ligeras de inmunoglobulinas dentro de una célula en condiciones que permiten el emparejamiento de regiones 45 variables;

(i) en el que al menos una de dichas regiones variables es una región variable de cadena ligera compatible de emparejamiento; y

(ii) en el que la composición de la mezcla está influenciada manipulando una cualquiera de los parámetros que afectan el nivel de expresión de las regiones variables logradas en la célula; y

(b) cosechar todos los anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpos que tienen especificidades de unión resultantes del citado emparejamiento.

Especificidades de unión se definen como interacciones entre moléculas que pueden distinguirse de las interacciones precedentes. Normalmente, las interacciones específicas entre moléculas tienen afinidad de unión más alta que las interacciones precedentes entre moléculas.

Las moléculas de unión específicas que por una parte importante están compuestas de residuos aminoacídicos (moléculas proteináceas) a menudo requieren el emparejamiento de secuencias de aminoácidos diferentes con el fin de construir un sitio de unión. Una secuencia de aminoácidos que se empareja con otra secuencia de aminoácidos para construir un sitio de unión se designa como región variable en el presente documento. Por supuesto una secuencia tal puede ser parte de una secuencia de aminoácidos más grande, que puede ser de nuevo parte de una molécula proteinácea más grande, por ejemplo como una subunidad. Por ejemplo, en un anticuerpo una región determinante de complementariedad (CDR) puede ser una región variable, pero una combinación de tres CDR con sus regiones estructurales puede considerarse también como una región variable. De acuerdo con la presente invención al menos dos sitios de de unión diferentes se construyen en un sistema, en un procedimiento. Así se llevaron conjuntamente regiones variables (secuencias de aminoácidos) en condiciones en las que pueden construir dos sitios de unión diferentes. Esto requiere al menos tres regiones variables, de las que una es capaz de emparejarse con ambas de las otras regiones variables, construyendo así dos sitios de unión específicos. Los dos sitios de unión específicos pueden estar en una molécula proteinácea o en diferentes moléculas proteináceas, o ambas cosas.

En anticuerpos del isotipo IgG por ejemplo esto sería un anticuerpo que tiene dos sitios de unión idénticos o diferentes. Produciendo las dos especificidades de unión en un sistema, solamente hay una fuente de los productos y por lo tanto menos riesgo de contaminación con virus, priones y similares. Un sistema tal puede ser un sistema libre de células, tal como un sistema de germen de trigo, pero se prefiere llevar a cabo procedimientos de acuerdo con la invención dentro de una célula, o de más células del mismo origen, preferentemente el origen de los sujetos a tratarse, normalmente humano. Para propósitos de producción y selección se prefieren normalmente otras células tales como bacterias, células de insectos, levaduras y otras eucariotas.

Si el emparejamiento de las regiones variables tiene lugar en una célula, después se prefiere que la producción de las regiones variables también tenga lugar en una célula, preferentemente la misma célula. Un modo particularmente útil de producir regiones variables es a través de la expresión de ácidos nucleicos que codifican estas regiones variables. Se prefiere que todas las regiones variables en una célula se produzcan por tal expresión, es por lo tanto también posible producir varias regiones variables de esta manera y haber llevado otras regiones variables, en base a técnicas diferentes de producción, o a los mismos medios de producción, pero en otra célula. Para la mayoría de los propósitos la naturaleza del ácido nucleico no es crítica, puede ser ARN, es preferentemente ADN, puede ser episomal o integrado, parte de un viral vector o un plásmido, etc. Sin embargo, para el sistema de producción final de la combinación de proteínas que tienen especificidades de unión diferentes, se prefiere que el ácido nucleico o los ácidos nucleicos que codifiquen las regiones variables estén integrados establemente en el genoma del huésped. La producción de regiones variables a través de la expresión de ácidos nucleicos que los codifican da la posibilidad de manipular las secuencias codificantes, permitiendo de este modo el diseño de especificidades... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para producir una mezcla que comprende al menos dos anticuerpos diferentes y/o dos fragmentos de anticuerpos diferentes, en el que al menos dos anticuerpos y/o fragmentos comprenden regiones variables emparejadas y diferentes especificidades de unión, comprendiendo dicho procedimiento

(a) poner en contacto al menos tres regiones variables diferentes derivadas de cadenas pesadas y cadenas ligeras de inmunoglobulinas dentro de una célula en condiciones que permiten el emparejamiento de regiones variables;

(i) en el que al menos una de dichas regiones variables es una región variable de cadena ligera compatible de emparejamiento; y

(ii) en el que se influye sobre la composición de la mezcla manipulando uno cualquiera de los parámetros que afectan el nivel de expresión de las regiones variables logrado en la célula; y

(b) cosechar todos los anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpos que tienen especificidades de unión resultantes del citado emparejamiento.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los niveles de expresión están afectados por elementos de control tales como promotores, potenciadores, aisladores y antirrepresores.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que todas las regiones variables las producen una o más secuencias de ácidos nucleicos que codifican estas regiones variables.

4. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la composición de la mezcla está influenciada por la expresión controlada de dichas regiones variables.

5. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la mezcla comprende una mezcla de diferentes anticuerpos monoespecíficos y biespecíficos y/o fragmentos de anticuerpos en una proporción dada particular.

6. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha región variable de cadena ligera de emparejamiento no contribuye significativamente a la especificidad de unión resultante del anticuerpo resultante y/o del fragmento de anticuerpo resultante.

7. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para producir una composición que comprende al menos tres anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpo que tienen diferentes especificidades de unión.

8. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos dos regiones variables diferentes se expresan a partir de uno o más ácidos nucleicos que codifican estas regiones variables, en donde la expresión de dichas regiones variables diferentes está sometida a la dirección de diferentes elementos de control.

9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dichos elementos de control diferentes conducen a una expresión diferencial.

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicha expresión diferencial es diferente en niveles de expresión y/o tiempo de expresión.

11. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las regiones variables compatibles de emparejamiento que comprenden una región variable de cadena ligera compatible de emparejamiento están seleccionadas a partir de bibliotecas de anticuerpos con diversidad de síntesis en una región variable, bibliotecas con diversidad natural o bibliotecas con una combinación de diversidad natural y de síntesis.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que las bibliotecas de anticuerpos son bibliotecas de presentación de fagos.

13. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las regiones variables compatibles de emparejamiento que comprenden una región variable de cadena ligera de emparejamiento están seleccionadas a partir de animales transgénicos.

14. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo es un scFV fusionado a una región Fc.

15. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los anticuerpos son anticuerpos IgM, IgE o IgG.

16. Una célula recombinante para llevar a cabo un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo ácidos nucleicos que codifican regiones variables conjuntamente con todos los elementos requeridos para la expresión génica y el emparejamiento, en donde dicha célula comprende medios para influir en la composición de la mezcla manipulando uno cualquiera de los parámetros que afectan al nivel de expresión de las regiones variables logrado en la célula.

17. La célula de acuerdo con la reivindicación 16, que es una célula eucariota.

18. Una colección de células de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16-17.

19. Un procedimiento para seleccionar combinaciones de anticuerpos o de fragmentos de anticuerpos que tienen afinidad específica por al menos un epítopo diana, que comprende poner en contacto una colección de acuerdo con la reivindicación 18 con dicho epítopo diana y seleccionar combinaciones que muestran dicha afinidad específica.

20. Un procedimiento para seleccionar combinaciones de anticuerpos o de fragmentos de anticuerpos que tienen afinidad específica por al menos dos epítopos diana, que comprende poner en contacto una colección de acuerdo con la reivindicación 18 con dichos dos epítopos diana y seleccionar combinaciones que muestran dicha afinidad específica.

21. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, en el que dichos dos epítopos diana están asociados con una enfermedad o un trastorno.

22. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, que comprende además someter una combinación seleccionada de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo a un ensayo biológico indicador de un efecto de la combinación sobre la enfermedad y/o el trastorno.

23. Un procedimiento para producir una mezcla que comprende al menos dos anticuerpos diferentes y/o fragmentos de anticuerpo, en los que dichos al menos dos anticuerpos y/o fragmentos comprenden regiones variables emparejadas y tienen diferentes especificidades de unión, comprendiendo dicho procedimiento

poner en contacto al menos tres regiones variables diferentes derivadas de cadenas pesadas y cadenas ligeras de inmunoglobulinas dentro de una célula en condiciones que permiten el emparejamiento de regiones variables,

en donde al menos una de dichas regiones variables es una región variable de cadena ligera compatible de emparejamiento;

cosechar todos los anticuerpos y/o fragmentos de los mismos que tienen especificidades de unión que resultan de dicho emparejamiento,

en donde las regiones variables se expresan a partir de uno o más ácidos nucleicos que codifican estas regiones variables,

en donde la expresión de dichas regiones variables está sometida a la dirección de diferentes elementos de control.

Biblioteca de anticuerpos con diversidad completa B. El concepto universal de anticuerpo