Anticuerpos y péptidos específicos de la integrina alfa II beta3.

Un péptido aislado y purificado que comprende de 9 a aproximadamente 50 restos aminoácidos,

y que tiene unasecuencia de restos aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:4, 5, 6 y 7, que tiene unaactividad que inhibe la agregación plaquetaria.

Anticuerpos y péptidos específicos de la integrina alfa II beta3

Campo técnico de la invención El campo técnico de la presente invención es la agregación plaquetaria. Más en concreto, la presente invención se refiere a anticuerpos y péptidos específicos de integrina, y al uso de estos compuestos para inhibir la agregación plaquetaria.

Antecedentes de la invención Los inhibidores de la integrina αIIbβ3 son una nueva clase de agente antitrombóticos que inhiben la unión del fibrinógeno a la integrina αIIbβ3, inhibiendo con ello las interacciones entre plaquetas, fundamentales para la formación de trombos plaquetarios (Topol, E. J., Byzova, T. V, y Plow, E. F. (1999) , Platelet GPIIb-IIIa blockers, Lancet, 353, 227-231; Coller, B. S. (1997) , Platelet GPIIb/ IIIa antagonists: the first anti-integrin receptor therapeutics, J. Clin. Invest., 99, 1467-1471) . Los inhibidores de la integrina αIIbβ3 se emplean para el tratamiento de pacientes con síndromes coronarios agudos sin elevación del segmento ST y pacientes sometidos a una intervención coronaria percutánea (Proimos, G. (2001) , Platelet aggregation inhibition with glycoprotein IIb-IIIa inhibitors, J. Thromb. Thrombolysis, 11, 99-110) . Entre estos inhibidores, el elabciximab (ReoPro, Centocor, Inc., Malvern, Pensilvania, y Eli Lilly & Company, Indianápolis, Indiana) (Coller, B. S. (1997) , Platelet CPIIb/IIIa antagonists: the first anti-integrin receptor therapeutics, J. Clin. Invest., 99, 1467-1471) , la eptifibatida (INTEGRILIN, COR Therapeutics, Inc., South San Francisco, California, y Key Pharmaceuticals, Inc., Kenilworth, Nueva Jersey) (Phillips, D. R., y Scarborough, R. M. (1997) , Clinical pharmacology of eptifibatide, Am. J. Cardiol., 80, 11B-20B; Scarborough, R. M. (1999) , Development of eptifibatide, Am. Heart. J., 138, 1093-1104) , y el tirofibano (Aggrastat, Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, Nueva Jersey) (Vickers, S., Theoharides, A. D., Arison, B., Balani, S. K., Cui, D., Duncan, C. A., Ellis, J. D., Gorham, L. M., Polsky, S. L., Prueksaritanont, T., Ramjit, H. G., Slaughter, D. E., y Vyas, K. P. (1999) , In vitro and in vivo studies on the metabolism of tirofiban, Drug Metab. Dispos., 27, 1360-1366) están aprobados clínicamente en EEUU. El abciximab, el primer agente aprobado y el más ampliamente utilizado, es un Fab quimérico con dominios variables de ratón y dominios constantes humanos. Se une a un epitopo adyacente a la región de unión del ligando e inhibe la unión del fibrinógeno mediante impedimento estérico. Se ha divulgado que el abciximab presenta reacción cruzada con la integrina αvβ3 y αMβ2 (Scarborough, R. M. (1999) , Development of eptifibatide, Am. Heart J., 138, 1093-1104) . La eptifibatida y el tirofibano, por otra parte, son fármacos de molécula pequeña que se unen al sitio de interacción con el ligando RGD de la integrina y son específicos de αIIbβ3. Muestran menor afinidad y unas semividas en la circulación mucho más cortas que el abciximab (Scarborough, R. M. (1999) , Development of eptifibatide, Am. Heart. J., 138, 1093-1104; Vickers, S., Theoharides, A. D., Arison, B., Balani, S. K., Cui, D., Duncan, C. A., Ellis, J. D., Gorham, L. M., Polsky, S. L., Prueksaritanont, T., Ramjit, H. G., Slaughter, D. E., y Vyas, K. P. (1999) , In vitro and in vivo studies on the metabolism of tirofiban, Drug Metab. Dispos., 27, 1360-1366; McClellan, K. J., y Goa, K. L. (1998) , Tirofiban. A review of its use in acute coronar y syndromes, Drugs, 56, 1067-1080) .

La trombocitopenia aguda es una complicación reconocida del tratamiento con inhibidores de la integrina αIIbβ3. La trombocitopenia, que a menudo es grave (número de plaquetas menor que 50 x 109/l) , aparece en 0, 5% al 1% de los pacientes que reciben abciximab por primera vez (Berkowitz, S. D., Sane, D. C:, Sigmon, K. N., Shavender, J. H., Harrington, R. A., Tcheng, J. E., Topol, E. J., y Califf, R. M. (1998) , Occurrence and clinical significance of thrombocytopenia in a population undergoing high-risk percutaneous coronar y revascularization, Evaluation of c7E3 for the Prevention of Ischemic Complications (EPIC) Study Group, J. Am. Coll. Cardiol., 32, 311-319; Jubelirer, S. J., Koenig, B. A., y Bates, M. C. (1999) , Acute profound thrombocytopenia following C7E3 Fab (Abciximab) therapy: case reports, review of the literature and implications for therapy, Am. J. Hematol., 61, 205-208; Kereiakes, D. J., Berkowitz, S. D., Lincoff, A. M., Tcheng, J. E., Wolski, K., Achenbach, R., Melsheimer, R., Anderson, K., Califf, R. M., y Topol, E. J. (2000) , Clinical correlates and course of thrombocytopenia during percutaneous coronar y intervention in the era of abciximab platelet glycoprotein IIb/IIIa blockade, Am. Heart J., 140, 74-80) y en 4% de los pacientes después de una segunda administración (Madan, M., Kereiakes, D. J., Hermiller, J. B., Rund, M. M., Tudor, G., Anderson, L., McDonald, M. B., Berkowitz, S. D., Sketch, M. H., Jr., Phillips, H. R., 3º, y Tcheng, J. E. (2000) , Efficacy of abciximab readmiriistration in coronar y intervention, Am. J. Cardiol., 85, 435-440; Tcheng, J. E., Kereiakes, D. J., Braden, G. A., Jordan, R. E., Mascelli, M. A., Langrall, M. A., y Effron, M. B. (1999) , Readministration of abciximab: interim report of the ReoPro readministration registr y , Am. Heart J., 138, S33-38) . En ensayos clínicos del tirofibano, la incidencia varía del 0, 1% al 0, 5%, que es solo el doble de la incidencia observada en pacientes que no reciben el fármaco (The RESTORE Investigators. Randomized Efficacy Study of Tirofiban for Outcomes and Restenosis (1997) , Effects of platelet glycoprotein IIb/IIIa blockade with tirofiban on adverse cardiac events in patients with unstable angina or acute myocardial infarction undergoing coronar y angioplasty, Circulation, 96, 1445-1453; Platelet Receptor Inhibition in Ischemic Syndrome Management (PRISM) Study Investigators (1998) , A comparison of aspirin plus tirofiban with aspirin plus heparin for unstable angina, N. Engl. J. Med., 338, 1498

1505; Platelet Receptor Inhibition in Ischemic Syndrome Management in Patients Limited by Unstable Signs and Symptoms (PRISM-PLUS) Study Investigators (1998) , Inhibition of the platelet glycoprotein IIb/IIIa receptor with tirofiban in unstable angina and non-Q-wave myocardial infarction, N. Engl. J. Med., 338, 1488-1497) . En el ensayo PURSUIT de eptifibatida, la incidencia fue aproximadamente la misma en pacientes a los que se le administró el fármaco de estudio que en pacientes que recibieron un placebo (McClure, M. W., Berkowitz, S. D., Sparapani, R., Tuttle, R., Kleiman, N. S., Berdan, L. G., Lincoff, A. M., Deckers, J., Diaz, R., Karsch, K. R., Gretler, D., Kitt, M., Simoons, M., Topol, E. J., Califf, R. M., y Harrington, R. A. (1999) , Clinical significance of thrombocytopenia during a non-ST-elevation acute coronar y syndrome. The platelet glycoprotein IIb/ IIIa in unstable angina: receptor suppression using integrilin therapy (PURSUIT) trial experience, Circulation, 99, 2892-2900) . Solo un pequeño subconjunto de pacientes que recibieron eptifibatida presentan una inexplicable trombocitopenia profunda (McClure,

M. W., Berkowitz, S. D., Sparapani, R., Tuttle, R., Kleiman, N. S., Berdan, L. G., Lincoff, A. M., Deckers, J., Díaz, R., Karsch, K. R., Gretler, D., Kitt, M., Simoons, M., Topol, E. J., Califf, R. M., y Harrington, R. A. (1999) , Clinical significance of thrombocytopenia during a non-ST-elevation acute coronar y syndrome. The platelet glycoprotein IIb/IIIa in unstable angina: receptor suppression using integrilin therapy (PURSUIT) trial experience, Circulation, 99, 2892-2900) . La causa de la trombocitopenia inducida por la integrina αIIbβ3 es desconocida, aunque se ha divulgado que los anticuerpos humanos contra los dominios variables de ratón del abciximab, inducidos probablemente por la primera exposición al abciximab, son la causa de la destrucción de las plaquetas en los pacientes que han desarrollado trombocitopenia grave después de recibir abciximab por segunda vez (Curtis, B. R., Swyers, J., Divgi, A., McFarland, J. G., y Aster, R. H. (2002) , Thrombocytopenia after second exposure to abciximab is caused by antibodies that recognize abciximab-coated platelets, Blood, 99, 2054-2059) .

Las integrinas αvβ3, αvβ5, αIIbβ3 y α5β1 se unen a una diversidad de proteínas adhesivas que contienen el tripéptido Arg-Gly-Asp (RGD) . Aprovechando esta característica, se seleccionaron mAb humanos sintéticos que imitan a la proteína adhesiva que contienen un motivo RGD en HCDR3 flanqueado por seis restos aleatorizados, a partir de bancos de anticuerpos mediante presentación de fagos (Barbas, C. F., 3º, Languino, L. R., y Smith, J. W. (1993) , High-affinity... [Seguir leyendo]

1. Un péptido aislado y purificado que comprende de 9 a aproximadamente 50 restos aminoácidos, y que tiene una secuencia de restos aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:4, 5, 6 y 7, que tiene una actividad que inhibe la agregación plaquetaria.

2. El péptido de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de restos aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO:5-7. 3. El péptido de la reivindicación 2, que consiste en cualquiera de SEQ ID NO:5-7.

4. El péptido de la reivindicación 2, que consiste fundamentalmente en cualquiera de SEQ ID NO:5-7. 5. Un anticuerpo que inmunorreacciona específicamente con la integrina αIIbβ3, y que comprende una secuencia de restos aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, 25, 26, 27, 28, 29, 30 y 31, en el que la secuencia de restos aminoácidos está dentro de la región determinante de la complementariedad HCDR3 del anticuerpo.

6. El anticuerpo de la reivindicación 5, seleccionado del grupo que consiste en:

i) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende VH3 DP-47, una HCDR3 que comprende la secuencia VRVVCRADRRCYAMDV, y un dominio VL que comprende VKVI DPK26/A26; ii) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende VH3 DP-47, una HCDR3 que comprende la

secuencia VGVWCRADRRCYAMDV, y un dominio VL que comprende VKVI DPK26/A26;

iii) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende VH3 DP-47, una HCDR3 que comprende la secuencia VRVVCRADRRCYAMDV, y un dominio VL que comprende VKIII Vg/38K; iv) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende VH3 DP-47, una HCDR3 que comprende la

secuencia VGVWCRADRRCYAMDV, y un dominio VL que comprende VkVI DPK26/A26;

v) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende VH3 DP-47, una HCDR3 que comprende la secuencia VRVVCRADRRCYAMDV, y un dominio VL que comprende VL8 8a.88E1/DPL21; vi) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende VH3 DP-47, una HCDR3 que comprende la

secuencia VGVWCRADKRCYAMDV, y un dominio VL que comprende VKIII 3A9;

vii) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende VH3 DP-47, una HCDR3 que comprende la secuencia VRVVCRADRRCYAMDV, y un dominio VL que comprende VL3 V2-14; viii) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende VH3 DP-47, una HCDR3 que comprende la

secuencia VGVVCRADRRCYAMDV, y un dominio VL que comprende VL2 2c.118D9/v1-2; y

ix) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende VH3 DP-47, una HCDR3 que comprende la secuencia VRVWCRADKRCYAMDV, y un dominio VL que comprende VKVI DPK26/A26; y que presenta inmunorreactividad con la integrina αIIbβ3. 7. El anticuerpo de la reivindicación 5 que es un anticuerpo humano. 8. Un anticuerpo que tiene la inmunorreactividad del anticuerpo de la reivindicación 6. 9. Un péptido de la reivindicación 1 o un anticuerpo de la reivindicación 5, para su uso como medicamento. 10. Un anticuerpo de la reivindicación 5 para su uso como medicamento para un tratamiento para prevenir la

trombosis. 11. Un anticuerpo que tiene actividad de unión a la integrina αIIbβ3, en el que la unión compite con la actividad de unión de otro anticuerpo, comprendiendo el otro anticuerpo una secuencia de restos aminoácidos dentro de una

región determinante de la complementariedad del otro anticuerpo, en el que la secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:8, 25, 26, 27, 28, 29, 30 y 31, y en el que la unión se realiza en un ensayo de competición convencional.

12. Un polinucleótido aislado y purificado que codifica un péptido que comprende de 9 a aproximadamente 50 5 restos aminoácidos, y que tiene una secuencia de restos aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:4, 5, 6 y 7, y el péptido tiene una actividad que inhibe la agregación plaquetaria.

13. Un vector que comprende el polinucléotido de la reivindicacón 12.

14. Una célula hospedante que comprende el vector de la reivindicación 13.

15. Un procedimiento de uso de un polinucleótido para producir una proteína, comprendiendo el procedimiento:

a) cultivar la célula hospedante de la reivindicación 14 bajo condiciones para la expresión de proteínas; y

b) recuperar la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:4, 5, 6 y 7 a partir del cultivo de células hospedantes.

16. Una composición farmacéutica que comprende el péptido de la reivindicación 1 o el anticuerpo de la reivindicación 5 o la reivindicación 11, y un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado en una forma adecuada para la administración por vía intravenosa, intraarterial, en la circulación linfática, intraperitoneal, transdérmica, subcutánea, intramuscular, en el espacio articular, o mediante administración pulmonar.

17. Un anticuerpo según la reivindicación 11 para su uso como medicamento.

18. Un péptido según la reivindicación 1 o un anticuerpo de la reivindicación 5 o la reivindicación 11, para su uso como medicamento para un tratamiento para prevenir la trombosis en trastornos seleccionados del grupo que consiste en embolia pulmonar, ataques isquémicos transitorios (TIA) , trombosis de venas profundas, cirugía de bypass coronario, y cirugía para insertar una válvula o un vaso prostético en un injerto de vasos autólogo, no autólogo o sintético.

19. Un péptido según la reivindicación 1 o un anticuerpo de la reivindicación 5 o la reivindicación 11, para su uso como medicamento para un tratamiento para prevenir la trombosis en un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en procedimientos de angioplastia realizados con balón, aterectomía coronaria y angioplastia de láser.