Anticuerpos para Dkk-1.

Un anticuerpo aislado o un fragmento inmunológicamente funcional del mismo que se une específicamente a una proteína Dkk-1 humana madura,

que consiste en los aminoácidos 32-266 del SEQ ID NO: 2, en donde dicho anticuerpo se une a un epítopo que comprende dos bucles, estando formados dichos bucles por enlaces disulfuro y encontrándose dichos bucles entre 220 y 237 del SEQ ID NO: 2 y entre los residuos de cisteína 245 y 263 del SEQ 5 ID NO: 2.

Anticuerpos para Dkk-1.

Campo de la invención La invención se refiere a agentes de unión selectiva para la proteína dickkopf-1 (Dkk-1) , y más concretamente, a anticuerpos y dominios de unión a antígeno y regiones CDR que median la unión selectiva a un epítopo localizado en la mitad carboxilada de la proteína Dkk-1.

Antecedentes de la invención El tejido óseo vivo muestra un equilibrio dinámico entre el depósito y la resorción de hueso. Estos procesos están mediados principalmente por dos tipos de células: osteoblastos, que secretan moléculas que comprenden la matriz orgánica del hueso, y osteoclastos, que median la disolución de la matriz ósea y la solubilización de las sales del hueso. En individuos jóvenes con hueso en crecimiento, la tasa de depósito óseo excede la tasa de resorción ósea, mientras en individuos de edad más avanzada la tasa de resorción puede exceder el depósito conduciendo a una pérdida neta de masa ósea. Esta última situación puede conducir a un incremento del riesgo de fractura ósea y a una reparación lenta o incompleta de los huesos rotos. La comprensión del mecanismo molecular que subyace a estos procesos es crítica para el desarrollo de agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades óseas. La genética humana ha jugado un papel principal en la elucidación de estos mecanismos y ha permitido la identificación de múltiples factores implicados en la actividad tanto catabólica como anabólica del hueso (Janssens and Van Hul, Hum Mol Gen, 11 (20) :2385-93, 2002; Ralston, J Clin Endocrin Metab. 87 (6) :2460-66, 2002) .

Dickkopf-1 (Dkk-1) es un miembro de la familia de proteínas dickkopf que se ha demostrado que son reguladores negativos de la ruta de señalización canónica de Wnt, que tiene un papel central en el desarrollo y la formación de hueso (véanse, por ejemplo, Glinka et al., Nature 391:357-62 (1998) ; Fedi et al., J Biol Chem 274 (27) :19465-72 (1999) ; Zorn, Curr Biol 11:R592-95 (2001) ; y Krupnik et al., Gene 238: 301-13 (1999) ) . Dkk-1 inhibe la señalización Wnt a través de su correlación con los receptores de Wnt LRP5 o LRP6 y las proteínas kremen (véanse, por ejemplo, Bafico et al, Nature Cell Biol 3:683 (2001) ; Mao et al, Nature 411 (17) :321 (2001) ; Mao et al, Nature 417:664 (2002) ; y Semënov et al, Curr Biol 11:951-61 (2001) . Por medio de la unión de LRP5 (LRP6) y proteínas kremen, Dkk-1 evita que LRP5 o LRP6 se asocien con miembros de la ruta Wnt y de ese modo evita la transducción de la señal mediada por Wnt, que a su vez da como resultado la inhibición de la formación de hueso.

LRP5 es una proteína clave en la regulación de la masa ósea (véanse, por ejemplo, Gong et al., Cell 107:513-23 (2001) ; Patel, N Eng J Med 346 (20) :1572 (2002) ) . Se ha identificado un trastorno recesivo autosómico caracterizado por una baja masa ósea (síndrome de osteoporosis-pseudoglioma, u "OPPG") que está causado por mutaciones de pérdida de función en LRP5 (Gong et al, 2001) . Además, se ha demostrado que las mutaciones de ganancia de función en LRP5 dan como resultado una masa ósea elevada dominante autosómica en seres humanos (Little et al., Am J Human Genetics. 70 (1) :11-19, 2002) . Las mismas mutaciones en LRP5 que dan como resultado una masa ósea elevada pueden interferir en la capacidad de Dkk-1 para inhibir la señalización de LRP5 (véase, por ejemplo, Boy den et al., N Eng J Med. 346 (20) :1513-1521, 2002) . De este modo, Dkk-1 se caracteriza apropiadamente por ser un regulador negativo del depósito óseo.

En vista de la implicación de Dkk-1 en la regulación de la formación de hueso y su papel en otras diversas enfermedades que están asociadas con la pérdida de hueso (p. ej., cáncer y diabetes) , existe una necesidad de anticuerpos anti-Dkk-1 mejorados para uso terapéutico y para otros propósitos.

Breve resumen de la invención La presente invención proporciona anticuerpos aislados y fragmento inmunológicamente funcionales de los mismos que se unen específicamente a una proteína de Dkk-1 humana madura que consiste en los aminoácidos 32-266 del SEC ID NO: 2, en donde dicho anticuerpo se une a un epítopo que comprende dos bucles, estando formados dichos bucles por enlaces disulfuro y estando dichos bucles entre 220 y 237 del SEC ID NO: 2 y entre los residuos de cisteína 245 y 263 del SEC ID NO: 2.

Los anticuerpos o fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos pueden comprender:

(a)

(i) una CDR1 de LC con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEC ID NO: 70; y

(ii) una CDR2 de LC con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEC ID NO: 72; y

(iii) una CDR3 de LC con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEC ID NO: 74; y

(b)

(i) una CDR1 de HC con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEC ID NO: 76; y

(ii) una CDR2 de HC con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEC ID NO: 78; y

(iii) una CDR3 de HC con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEC ID NO: 80.

En un aspecto relacionado, los anticuerpos aislados y los fragmentos inmunológicamente funcionales comprenden:

una región variable de la cadena ligera (VL) que tiene una identidad de secuencia de al menos 80% con el SEC ID NO: 84; y

una región variable de la cadena pesada (VH) que tiene una identidad de secuencia de al menos 80% con el SEC ID NO: 91.

De acuerdo con una realización preferida adicional, la presente invención proporciona anticuerpos y fragmentos inmunológicamente funcionales de los mismos que compiten con los anticuerpos definidos anteriormente por la unión específica a un polipéptido Dkk-1.

En otro aspecto, la presente invención proporcionar un ácido nucleico que codifica una CDR de la cadena ligera con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEC ID NO: 70, 72 y/o 74; y/o

una CDR de la cadena pesada con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEC ID NO: 70, 78 y/o 80,

en donde el ácido nucleico codifica un anticuerpo como se ha definido anteriormente.

La presente invención proporciona adicionalmente vectores de expresión que comprenden los respectivos ácidos nucleicos y células aisladas que comprenden los respectivos vectores de expresión.

Adicionalmente se proporcionan métodos para producir un anticuerpo o un fragmento inmunológicamente activo del mismo que comprende la etapa de cultivar las respectivas células. De acuerdo con una realización adicionalmente preferida de la presente invención se proporcionan composiciones farmacéuticas, que comprenden un anticuerpo o un fragmento inmunológicamente funcional del mismo como se ha descrito anteriormente y un componente seleccionado del grupo que consiste en un tampón, un diluyente farmacéuticamente aceptable, un portador, un agente solubilizador, un emulsionante y un conservante.

Los anticuerpos y los fragmentos inmunológicamente activos de los mismos descritos anteriormente también se pueden utilizar para la preparación de una composición farmacéutica para su uso en la reparación ósea o para tratar una enfermedad, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en artritis, un trastorno óseo y un cáncer que incrementa la actividad de los osteoclastos e induce la resorción ósea.

En aspectos relacionados, los anticuerpos y los fragmentos inmunológicamente activos de los mismos se pueden utilizar para la preparación de una composición farmacéutica para tratar a un paciente con cáncer que experimenta terapia con radiación o quimioterapia y para tratar el mieloma múltiple.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra un diagrama de cintas que representa la estructura tridimensional de un segmento de Dkk-1 humana localizado cerca del extremo carboxi de la proteína. Todos los números de aminoácidos indicados en la figura corresponden a la secuencia de aminoácidos del SEC ID NO: 2. Las dos secuencias de péptidos representadas en la figura representan regiones que son importantes para que el anticuerpo monoclonal 11H10 se una específicamente a esta proteína. Se cree que los aminoácidos que se encuentran subrayados juegan un papel importante para la unión del anticuerpo a la proteína de Dkk-1. Los bucles que comprenden el epítopo están sombreados, estando uno de los dos bucles del epítopo sombreado ligeramente más oscuro que el otro bucle. Las porciones de color muy claro del diagrama de cintas representan partes del polipéptido que se cree que desempeñan un papel menor en la interacción de unión entre 11H10 y Dkk-1 humana.

Las Figuras 2A y 2B muestran resultados μCT para ratones jóvenes y viejos tratados con 11H10 de rata. La Figura 2A es una representación gráfica del número trabecular... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo aislado o un fragmento inmunológicamente funcional del mismo que se une específicamente a una proteína Dkk-1 humana madura, que consiste en los aminoácido.

3. 266 del SEQ ID NO: 2, en donde dicho anticuerpo se une a un epítopo que comprende dos bucles, estando formados dichos bucles por enlaces disulfuro y encontrándose dichos bucles entre 220 y 237 del SEQ ID NO: 2 y entre los residuos de cisteína 245 y 263 del SEQ ID NO: 2.

2. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional se une a dos regiones separadas localizadas entre los aminoácidos 221262 del SEQ ID NO: 2.

3. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional se une a dos regiones separadas, en donde una región consiste en los aminoácido.

22. 236 del SEQ ID NO: 2 y la segunda región consiste los aminoácido.

24. 262 del SEQ ID NO: 2.

4. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de la reivindicación 2, en donde una región consiste en los aminoácido.

22. 229 del SEQ ID NO: 2 y la segunda región consiste en los aminoácido.

24. 253 del SEQ ID NO: 2.

5. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende:

(a)

(i) una CDR1 de LC con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 70; y

(ii) una CDR2 de LC con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 72; y

(iii) una CDR3 de LC con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 74; y

(b)

(i) una CDR1 de HC con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 76; y

(ii) una CDR2 de HC con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 78; y

(iii) una CDR3 de HC la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 80.

6. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que consiste en dos VH idénticas y dos VL idénticas.

7. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que consiste en dos VH idénticas y dos VL idénticas, en donde

la VL tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 84; y la VH la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NIO: 91.

8. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de la reivindicación 7, que comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 82; y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 89.

9. Un anticuerpo o un fragmento inmunológicamente funcional del mismo que compite con un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, por la unión específica a un polipéptido Dkk-1.

10. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de la reivindicación 9, que compite con un anticuerpo que consiste en dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas, en el que dichas cadenas pesadas consisten en los aminoácido.

2. 465 del SEQ ID NO: 12 y dichas cadenas ligeras consisten en los aminoácido.

2. 234 del SEQ ID NO: 10.

11. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de la reivindicación 10, que se disocia del polipéptido Dkk-1 con una kd de 5 x 10-4 s-1 o menos.

12. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que es un anticuerpo monoclonal.

13. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que es un scFv, un Fab, un Fab' o un (Fab') 2.

14. El anticuerpo aislado o fragmento inmunológicamente funcional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es un anticuerpo humanizado.

15. Un ácido nucleico que codifica

(A) una CDR de la cadena ligera con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 70, 72 y/o 74, y/o (B) una CDR de la cadena pesada con la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 76, 78 y/o 80, en donde el ácido nucleico codifica un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

16. Un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica la VH, la VL o tanto la VH como la VL del anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

17. Un ácido nucleico que comprende un segmento de ácido nucleico que codifica la VH, la VL o tanto la VH como la VL del anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo de la reivindicación 7.

18. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 16.

19. Una célula aislada que comprende el vector de expresión de la reivindicación 18.

20. Un método de producción de un anticuerpo o un fragmento inmunológicamente activo del mismo, que comprende la etapa de cultivar una célula de acuerdo con la realización 19.

21. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y un componente seleccionado del grupo que consiste de un tampón, un diluyente farmacéuticamente aceptable, un portador, un solubilizante, un emulsionante y un conservante.

22. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento inmunológicamente activo del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, para su uso en un método para reparar hueso o para tratar una enfermedad, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en artritis, un trastorno óseo y un cáncer que aumenta la actividad de los osteoclastos e induce la resorción ósea.

23. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 22, en donde la enfermedad se selecciona entre artritis reumatoide, artritis soriásica, y osteoartritis.

24. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 22, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en osteopenia, osteoporosis, enfermedad de Paget, espondilitis anquilosante, periodontitis, reparación de hueso, pérdida de hueso debida a inmovilización o metástasis óseas líticas.

25. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 22, en donde la reparación de hueso es el tratamiento de una fractura ósea.

26. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el anticuerpo estimula la actividad de los osteoblastos y aumenta la densidad mineral ósea o la masa ósea.

27. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el tratamiento es una terapia combinada que comprende la administración del anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo combinado con un agente promotor del crecimiento óseo o un agente anti-resorción ósea.

28. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 27, en donde el agente promotor del crecimiento óseo o agente anti-resorción ósea se selecciona del grupo que consiste en factor morfogénico óseo BMP-1 a BMP-12, factor de crecimiento transformante β, factores de crecimiento de fibroblastos FGF-1 a FGF-10, un inhibidor de interleucina 1, un inhibidor de TNFα, un inhibidor de ligando RANK, hormona paratiroidea, una

prostaglandina de la serie E, un bisfosfonato, un mineral potenciador de hueso, y un agente anabólico.

29. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 28, en donde

(a) el inhibidor de interceucina 1 es IL-1ra, un anticuerpo para IL-1 o un anticuerpo para receptores de IL-1,

(b) el inhibidor de TNFα es etanercept, adalibumab o infliximab;

(c) el inhibidor del ligando RANK es RANK soluble, osteoprotegerina o un anticuerpo antagónico que se une específicamente a RANK o ligando de RANK;

(d) el mineral potenciador de hueso es fluoruro o calcio.

30. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento inmunológicamente activo del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, para su uso en un método para tratar a un paciente con cáncer que experimenta terapia de radiación o quimioterapia.

31. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 30, en donde el anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo se administra combinado con una antraciclina, taxol, tamoxifeno, doxorrubicina, 5-fluorouracilo, oxaloplatino, o ácido [ (1R) -3-metil-1-[[ (2S) -1-oxo-3-fenil-2