Anticuerpos anti-EGFR modificados con inmunogenicidad reducida.

Un anticuerpo modificado o fragmento del mismo seleccionado del grupo formado por fragmentos Fab',

F(ab')2, Fv y Fc, dianticuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmento(s) de anticuerpo dirigido(s) frente al receptor EGF (Her 1) que deriva del anticuerpo 425 murino y presenta -en comparación con el anticuerpo original no modificado 5 inmunogénicamente- un número reducido de epítopes de células T, los cuales son ligandos de MHC de clase II o secuencias peptídicas que muestran la capacidad de estimular o unirse a células T a través de presentación en clase II, por tanto, siendo sustancialmente no inmunogénicos o menos inmunogénicos que cualquier anticuerpo original inmunogénicamente no modificado dirigido frente al mismo receptor cuando se expone al sistema inmunitario de una determinada especie, donde dicho anticuerpo modificado presenta las secuencias 10 VH y VK seleccionadas del grupo formado por:

Anticuerpos anti-EGFR modificados con inmunogenicidad reducida ÁMBITO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere a la modificación del anticuerpo anti-EGFR 425 en sus distintas formas y fragmentos del mismo para obtener variantes AcM 425 que sean sustancialmente no inmunogénicas o menos inmunogénicas que cualquier homólogo no modificado cuando se usan in vivo, y a los métodos de fabricación de este anticuerpo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El receptor del factor de crecimiento epidérmico (receptor de EGF o EGFR, por sus siglas en inglés) , también conocido como c-erbB1/Her1, y el producto del oncogén neu (también conocido como c-erbB2/Her 2) son los miembros de la superfamilia de receptores de EGF, la cual pertenece a la gran familia de receptores tirosina quinasa. Interaccionan en la superficie celular con factores de crecimiento específicos o ligandos naturales, tales como EGF o TGF alfa y, de este modo, activan el receptor tirosina quinasa. Se activa una cascada de proteínas de señalización anterógradas en general produciendo una expresión génica alterada y tasas de crecimiento aumentadas.

C-erbB2 (Her 2) es una tirosina quinasa transmembrana que tiene un peso molecular de aproximadamente 185.000 con una homología considerable al receptor de EGF (Her 1) , aunque hasta el momento todavía no se ha identificado claramente un ligando específico para Her 2.

El receptor de EGF es una glicoproteína transmembrana que tiene un peso molecular de 170.000 y se encuentra en muchos tipos de células epiteliales. Se activa al menos mediante tres ligandos, EGF, TGF- (factor de crecimiento transformante alfa) y anfirregulina. Se ha demostrado que tanto el factor de crecimiento epidérmico (EGF) como el factor de crecimiento transformante alfa (TGF-) se unen al receptor de EGF e inducen la proliferación celular y el crecimiento tumoral. Estos factores de crecimiento no se unen a Her2 (Ulrich y Schlesinger, 1990, Cell 61, 203) . Al contrario que varias familias de factores de crecimiento, que inducen la dimerización del receptor en virtud de su naturaleza dimérica (p. ej., PDGF) , los factores de crecimiento monomérico, como el EGF, contienen dos sitios de unión para sus receptores y, por tanto, pueden entrecruzar dos receptores de EGF vecinos (Lemmon y col., 1997, EMBO J. 16, 281) . La dimerización del receptor es esencial para la estimulación de la actividad catalítica intrínseca y para la autofosforilación de los receptores de factores de crecimiento. Debe destacarse que los receptores proteína tirosina quinasa (PTK) son capaces de sufrir tanto homo como heterodimerización.

Estudios clínicos indican que tanto el receptor de EGF como el c-erbB2 se sobrexpresan en determinados tipos de tumores, en especial cánceres de mama, ovario, vejiga, colon, riñón, cabeza y cuello y carcinomas escamosos de pulmón (Mendelsohn, 1989, Cancer Cells 7, 359; Mendelsohn, 1990, Cancer Biology 1, 339) . Por tanto, estas observaciones han estimulado investigaciones preclínicas cuyo objetivo es inhibir la función de los receptores de EGF o los c-erbB2 humanos como técnicas terapéuticas novedosas para tratar el cáncer (véase, p. ej., Baselga y col., 1996, J. Clin. Oncol. 14, 737; Fan y Mendelsohn, 1998, Curr. Opin. Oncol. 10, 67) . Se ha descrito que, por ejemplo, anticuerpos anti-EGF, así como anticuerpos anti-Her 2 muestran resultados provechosos en la terapia contra el cáncer en humanos. Por lo que el anticuerpo monoclonal humanizado 4D5 (AcMh 4D5, HERCEPTIN®) ya es un producto comercializado.

Se ha demostrado que los anticuerpos anti-receptor EGF al tiempo que bloquean la unión de EGF y TGF- al receptor pueden inhibir la proliferación de las células tumorales. A la vista de estos resultados, se han desarrollado varios anticuerpos monoclonales murinos y de rata frente al receptor de EGF en los que se ha comprobado su capacidad para inhibir el crecimiento de células tumorales in vitro e in vivo (Modjtahedi y Dean, 1994, J. Oncology 4, 277) .

El anticuerpo monoclonal humanizado 425 (AcMh 425, documentos US 5.558.864 y EP 0531 472) y el anticuerpo monoclonal quimérico 225 (AcMc 225) (Naramura y col., 1993, Cancer Immunol. Immunother. 37, 343-349, documento WO 96/40210) , dirigidos ambos frente al receptor de EGF, han mostrado su eficacia en ensayos clínicos.

Se demostró que el anticuerpo C225 inhibía el crecimiento in vitro de células tumorales mediado por EGF e inhibía la formación de tumores humanos in vivo en ratones lampiños. Además, parece que el anticuerpo actúa, sobre todo, en sinergia con determinados agentes quimioterapéuticos (es decir, doxorrubicina, adriamicina, taxol y cisplatino) para erradicar tumores humanos in vivo en modelos de xenotrasplante en ratones. Ye y col. (1999, Oncogene 18, 731) han publicado que las células de cáncer de ovario humano pueden tratase de forma eficaz con una combinación de AcMc 225 y AcMh 4D5.

Existen muchos casos en los que la eficacia de una proteína terapéutica está limitada por una reacción inmunitaria no deseada a dicha proteína terapéutica. Diversos anticuerpos monoclonales de ratón han mostrado ser prometedores como tratamientos en varios contextos patológicos humanos, pero en ciertos casos han fracasado debido a la inducción de grados significativos de respuesta de anticuerpos anti-murinos humanos (HAMA, por sus siglas en inglés) [Schroff, R. W. y col. (1985) Cancer Res. 45: 879-885; Shawler, D. L. y col. (1985) J. Immunol. 135: 1530-1535]. Para anticuerpos monoclonales, se han desarrollado varias técnicas para intentar reducir la respuesta HAMA [documentos WO 89/09622; EP 0239400; EP 0438310; WO 91/06667]. Estas técnicas de ADN recombinante generalmente han reducido la información genética del ratón en la construcción final del anticuerpo al tiempo que se aumentaba la información genética humana en dicha construcción final. No obstante, en varios casos, los anticuerpos «humanizados» resultantes han seguido desarrollando una respuesta inmune en pacientes [Issacs J. D. (1990) Sem. Immunol. 2: 449-456; Rebello, P. R. y col. (1999) Transplantation 68: 1417-1420].

Los anticuerpos no son la única clase de molécula polipeptídica administrada como agente terapéutico frente a la cual puede desarrollarse una respuesta inmunitaria. Incluso proteínas de origen humano y con las mismas secuencias de aminoácidos que las que aparecen en humanos pueden inducir una respuesta inmunitaria en humanos. Entre los ejemplos destacables se incluye el uso terapéutico del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos [Wadhwa, M. y col. (1999) Clin. Cancer Res. 5: 1353-1361] e interferón alfa 2 [Russo, D. y col. (1996) Bri. J. Haem. 94: 300-305; Stein, R. y col. (1988) New Engl. J. Med. 318: 1409-1413] entre otros.

Un factor clave en la inducción de una respuesta inmunitaria es la presencia en la proteína de péptidos que puedan estimular la actividad de las células T mediante su presentación en el contexto de las moléculas de MHC de clase II, los denominados «epítopes de células T». Estos epítopes potenciales de células T se definen normalmente como cualquier secuencia de restos de aminoácidos con capacidad para unirse a moléculas de MHC de clase II. Estos epítopes de células T pueden calcularse para que establezcan unión a MHC. De forma implícita, por «epítope de células T» se entiende un epítope que cuando se une a moléculas de MHC puede ser reconocido por un receptor de la célula T (TCR) y el cual puede, al menos en principio, causar la activación de estas células T acoplándose a un TCR para inducir una respuesta de células T. Sin embargo, normalmente se entiende que estos determinados péptidos que se han encontrado unidos a moléculas de MHC de clase II pueden retenerse en una secuencia proteica porque el organismo en el que se administra la proteína final los reconoce como «propios».

Se sabe que algunos de estos péptidos de epítopes de células T pueden liberarse durante la degradación de péptidos, polipéptidos o proteínas dentro de las células y posteriormente son presentados por moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC, por sus siglas en inglés) para desencadenar la activación de células T. Para péptidos presentados por MHC de clase II, esta activación de células T puede entonces dar lugar, por ejemplo, a una respuesta de anticuerpos mediante estimulación directa de células B para producir tales anticuerpos.

Las moléculas de MHC de clase II son un grupo de proteínas muy polimórficas que tienen una función central en la selección y activación de células T colaboradoras. El grupo DR de antígenos leucocitarios humanos (HLA-DR, por sus siglas en inglés) son el isotipo predominante de este grupo de proteínas y son el principal... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo modificado o fragmento del mismo seleccionado del grupo formado por fragmentos Fab’, F (ab’) 2,

Fv y Fc, dianticuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmento (s) de anticuerpo dirigido (s) frente al receptor EGF (Her 1) que 5 deriva del anticuerpo 425 murino y presenta –en comparación con el anticuerpo original no modificado inmunogénicamente– un número reducido de epítopes de células T, los cuales son ligandos de MHC de clase II

o secuencias peptídicas que muestran la capacidad de estimular o unirse a células T a través de presentación en clase II, por tanto, siendo sustancialmente no inmunogénicos o menos inmunogénicos que cualquier anticuerpo original inmunogénicamente no modificado dirigido frente al mismo receptor cuando se expone al

sistema inmunitario de una determinada especie, donde dicho anticuerpo modificado presenta las secuencias VH y VK seleccionadas del grupo formado por:

2. Un anticuerpo modificado según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo original no modificado inmunogénicamente es un anticuerpo quimérico.

3. Un anticuerpo modificado según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo original no modificado inmunogénicamente es un anticuerpo no humano que incluye restos superficiales excepto aquellos que no se encuentran cerca de las regiones CDR, que derivan de las correspondientes secuencias estructurales humanas (anticuerpo chapado) .

4. Un anticuerpo modificado según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo original no modificado inmunogénicamente es AcM 425 murino.

5. Una secuencia de ADN que codifica para la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo modificado según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4.

6. Una composición farmacéutica que incluya un anticuerpo anti-EGFR modificado como se ha definido previamente en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4, opcionalmente junto con un vehículo, diluyente

o excipiente farmacéuticamente aceptable.

7. Una composición farmacéutica de la reivindicación 6 que contenga, además, una cantidad farmacológicamente eficaz de un fármaco citotóxico.

8. Un método para fabricar un anticuerpo anti-EGFR (HER-1) modificado que deriva del AcM 425 murino y presenta –en comparación con el anticuerpo original no modificado inmunogénicamente– un número reducido de epítopes de células T, los cuales son ligandos de MHC de clase II o secuencias peptídicas que muestran la capacidad de estimular o unirse a células T a través de presentación en clase II, por tanto, siendo sustancialmente no inmunogénicos o menos inmunogénicos que cualquier anticuerpo original no modificado inmunogénicamente dirigido frente al mismo receptor cuando se expone al sistema inmunitario de una determinada especie, que consta de las etapas:

(i) determinación de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y/o ligera del anticuerpo original no modificado inmunogénicamente o parte del mismo.

(ii) identificación de uno o más epítopes potenciales de células T en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo mediante cualquier método que incluya la determinación de la unión de los péptidos a las moléculas de MHC usando técnicas in vitro o in silico o ensayos biológicos; dicha identificación se lleva a cabo mediante las siguientes etapas:

(a) selección de una región del péptido que tenga una secuencia de restos de aminoácidos conocida;

(b) fragmentación secuencial de segmentos de restos de aminoácidos solapados de tamaño uniforme predeterminado y constituidos por al menos tres restos de aminoácidos de la región seleccionada; (c) cálculo de la puntuación de unión a la molécula de MHC de clase II para cada uno de dichos segmentos fragmentados sumando los valores asignados para cada cadena lateral de resto de aminoácidos hidrófoba presente en dicho segmento de resto de aminoácidos fragmentado;

dicha etapa incluye el empleo de una función de puntuación de Böhm modificada para incluir el término 12-6 de energía de repulsión ligando-proteína de Van der Waals y el término de energía conformacional del ligando mediante

(1) la provisión de una primera base de datos de cadenas principales peptídicas permitidas para dichos modelos de moléculas de MHC de clase II,

(2) la provisión de una segunda base de datos de cadenas principales peptídicas permitidas para dichos modelos de moléculas de MHC de clase II;

(3) la selección de un modelo de dicha primera base de datos;

(4) la selección de una cadena principal peptídica permitida a partir de dicha segunda base de datos;

(5) la identificación de cadenas laterales de restos de aminoácidos presentes en cada segmento fragmentado;

(6) la determinación del valor de afinidad de unión para todas las cadenas laterales presentes en cada segmento fragmentado, y la repetición de las etapas de la (1) a la (5) para cada uno de dichos modelos y cada una de dichas cadenas principales, y

(d) identificación de al menos uno de dichos segmentos como adecuado para modificación, en base a la puntuación de unión a molécula de MHC de clase II calculada para ese segmento, para cambiar la puntuación global de unión a molécula de MHC de clase II para el péptido sin reducir sustancialmente la utilidad terapéutica del péptido (iii) el diseño de nuevas variantes de secuencia con uno o más aminoácidos dentro de los epítopes potenciales de células T identificados modificados de modo que se reduzca sustancialmente o se elimine la actividad del epítope de células T, según se determinó mediante la unión de los péptidos a moléculas de MHC usando técnicas in vitro o in silico, o ensayos biológicos, o mediante la unión de complejos péptido-MHC a células T; dicha modificación de epítopes de células T se lleva a cabo mediante la sustitución de 1 a 9 restos de aminoácidos en cualquier epítope de células T presente en un principio;

(iv) la construcción de estas variantes de secuencia mediante técnicas de ADN recombinante y el análisis de dichas variantes para identificar una o más variantes con las propiedades deseables; y

(v) la repetición opcional de las etapas de la (ii) a la (iv) .

9. El método de la reivindicación 8, en el que dicho anticuerpo anti-EGFR original no modificado inmunogénicamente es un anticuerpo quimérico.

10. El método de la reivindicación 8, en el que dicho anticuerpo original no modificado inmunogénicamente es un anticuerpo no humano que incluye restos superficiales excepto aquellos que no se encuentran cerca de las regiones CDR, que derivan de las correspondientes secuencias estructurales humanas (anticuerpo chapado) .

11. Un método de la reivindicación 8, en el que dicho anticuerpo anti-EGFR original no modificado inmunogénicamente es el AcM 425 murino.

12. Un método de cualquiera de las reivindicaciones de la 8 a la 11, en el que dicho anti-EGFR presenta secuencias VH y VK seleccionadas del grupo formado por: