Anticuerpo específico para PRLR y usos del mismo.

Un anticuerpo que tiene una constante de disociación en equilibrio de 10-6 M o inferior con respecto a PRLR y que comprende 6 CDR,

en el que:

(a) (i) CDRL1 tiene la secuencia RASKSVSTSGYTYMH;

(ii) CDRL2 tiene la secuencia LASNLES;

(iii) CDRL3 tiene la secuencia QHSGELPPS;

(iv) CDRH1 tiene la secuencia SYGMS;

(v) CDRH2 tiene la secuencia ATVSSGGTYTYYPDSVKG; y

(vi) CDRH3 tiene la secuencia HRGNYYATYYYAMDY; o

(b) (i) CDRL1 tiene la secuencia KASKSVSTSGYTYMH;

(ii) CDRL2 tiene la secuencia LASNRES;

(iii) CDRL3 tiene la secuencia QHSGELPPS;

(iv) CDRH1 tiene la secuencia SYGMS;

(v) CDRH2 tiene la secuencia TVSSGGTYTYYPDSVKG; y

(vi) CDRH3 tiene la secuencia HRGNYYATYYYAMDY.

Anticuerpo específico para PRLR y usos del mismo.

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a procedimientos para prevenir y tratar cáncer administrando anticuerpos específicos para PRLR.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El cáncer es la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos. Aunque “cáncer” se usa para describir muchos tipos diferentes de cáncer, es decir, mama, próstata, pulmón, colon, páncreas, cada tipo de cáncer se diferencia tanto al nivel fenotípico como al nivel genético. La característica de crecimiento sin regular del cáncer se produce cuando la expresión de uno o más genes se desregula debido a mutaciones, y el crecimiento celular ya no puede controlarse.

Los genes se clasifican frecuentemente en dos clases, oncogenes y genes supresores de tumores. Los oncogenes son genes cuya función normal es promover el crecimiento celular, pero solo bajo condiciones específicas. Cuando un oncogén obtiene una mutación y luego pierde ese control, promueve el crecimiento bajo todas las condiciones. Sin embargo, se ha encontrado que para el cáncer es de verdad satisfactorio que el cáncer también deba adquirir mutaciones en genes supresores de tumores. La función normal de genes supresores de tumores es detener el crecimiento celular. Ejemplos de supresores tumorales incluyen p53, p16, p21 y APC, todos los cuales, cuando actúan normalmente, detienen la división y el crecimiento incontrolado de una célula. Cuando un supresor tumoral se muta o pierde, ese freno del crecimiento celular también se pierde, permitiendo que las células crezcan ahora sin limitaciones.

El receptor de prolactina (PRLR) es un receptor de citocinas de clase 1 que atraviesan una única membrana que es homólogo a receptores para miembros de la superfamilia de las citocinas, tales como los receptores para IL2, IL3, IL4, IL6, IL7, eritropoyetina y GM-CSF. PRLR participa en múltiples funciones biológicas, que incluyen crecimiento celular, diferenciación, desarrollo, lactancia y reproducción. No tiene actividad intrínseca de tirosina cinasas; la unión a ligando conduce a dimerización del receptor, fosforilación cruzada de Jak2 y señalización aguas abajo. El ADNc de receptor de prolactina humana se aisló originariamente de bibliotecas de hepatoma y cáncer de mama (Boutin, J. M. y col., Molec. Endocr. 3: 1455-1461, 1989) . La secuencia de nucleótidos predijo una proteína madura de 598 aminoácidos con un dominio citoplásmico mucho más largo que el receptor de PRL de hígado de rata. El gen del receptor de prolactina reside en la misma región cromosómica que el gen del receptor de la hormona de crecimiento, que se ha mapeado en 5;13-p12 (Arden, K. C. y col. Cytogenet. Cell Gene 53: 161-165, 1990; Arden, K.C. y col., (Resumen) AM. J. Hum. Genet. 45 (supl.) : A129 solo, 1989) . La hormona de crecimiento también se une al receptor de prolactina y activa el receptor.

Se ha determinado la organización genómica del gen de PRLR humano (Hu, Z. Z. y col., J. Clin. Endocr. Metab. 84: 1153-1156, 1999) . La región sin traducir 5 prima del gen de PRLR contiene 2 primeros exones alternativos: E13, el homólogo humano de E13 de rata y de ratón, y un tipo humano novedoso de primer exón alternativo llamado E1N. La región sin traducir 5 prima también contiene un exón 2 no codificante común y parte del exón 3, que contiene el codón de iniciación de la traducción. Los exones E13 y E1N están dentro de 800 pares de bases mutuamente. Estos 2 exones se expresan en tejido de mama humano, células de cáncer de mama, gónadas e hígado. En general, el transcrito que contiene E13 es predominante en la mayoría de los tejidos. El producto génico de PRLR está codificada por los exones 3-10, de los que el exón 10 codifica la mayoría del dominio intracelular. Los exones E13 y E1N se transcriben de promotores alternativos PIII y PN, respectivamente. El promotor PIII contiene elementos Sp1 y C/EBP que son idénticos a aquellos en el promotor de roedor y es el 81 % similar a la región -480/-106 en la rata y ratón. El promotor PN contiene sitios de unión putativos para las proteínas de la familia ETS y un medio sitio para receptores nucleares.

PRLR existe en varias isoformas diferentes que se diferencian en la longitud de sus dominios citoplásmicos. Se han demostrado cuatro isoformas de ARNm de PRLR (L, I, S1a y S1b) en tejido adiposo abdominal subcutáneo humano y tejido adiposo de mama (Ling, C. y col., J. Clin. Endocr. Metab. 88: 1804-1808, 2003) . Además, detectaron la expresión de proteínas L-PRLR y I-PRLR en tejido adiposo abdominal subcutáneo humano y tejido adiposo de mama usando análisis de inmunotransferencia. La PRL redujo la actividad de lipoproteína lipasa en tejido adiposo humano en comparación con control. Ling y col. sugieren que estos resultados demostraron un efecto directo de PRL, mediante PRLR funcionales, en reducir la actividad de LPL en tejido adiposo humano, y que estos resultados sugirieron que LPL también podría regularse de este modo durante la lactancia. Se ha aclarado la función de estas isoformas de PRLR en rata (Perrot-Applanat, M. y col., Molec. Endocr. 11: 1020-1032, 1997) . Al igual que la forma larga conocida (591 aminoácidos) , la forma Nb2, que carece de 198 aminoácidos del dominio citoplásmico, puede transmitir una señal lactogénica. A diferencia, la forma corta, que carece de 291 aminoácidos del dominio citoplásmico, es inactiva. La función de la forma corta se examinó después de la cotransfección de tanto las formas largas como cortas. Estos resultados muestran que la forma corta actúa de inhibidor negativo dominante mediante la formación de heterodímeros inactivos, produciendo la inhibición de la activación de la cinasa 2 de Janus. Perrot-Applanat y col. sugieren que la heterodimerización de PRLR puede activar positivamente o negativamente la transcripción de PRL.

Informes recientes han sugerido que PRLR se expresa en exceso en tejidos humanos de cáncer de mama y de cáncer de próstata (Li y col., Cancer Res., 64:4774-4782, 2004; Gill y col., J Clin Pathol., 54:956-960, 2001; Touraine y col., J Clin Endocrinol Metab., 83:667-674, 1998) . Li y col. Informaron que la activación de Stat5 y la expresión de PRLR está asociada a alto grado histológico en el 54 % de los especímenes de cáncer de próstata (Li y col., arriba, Li y col. Oncogene 25: 1896-1902 analiza la fosforilación de PRLR en muestras de tumor) . Otros informes han sugerido que los especímenes de cáncer de mama primario son sensibles a PRL en ensayos de formación de colonias y que las concentraciones de PRL en plasma se correlacionan con riesgo de cáncer de mama (Dosroger y col., Cancer Res., 64:6814-6819, 2004; Dosroger y col., Cancer Res., 66:2476-2482, 2006) . Otro informe indicó que ratones transgénicos para PRL desarrollan carcinomas de mama malignos o hiperplasia de próstata (Wennbo y col., J Clin Invest., 100:2744-2751, 1997; Wennbo y col., Endocrinology, 138:4410-4415, 1997) . El mAb 1167 de R&D Systems se une a PRLR. Zhang-zhi y col., J. Biol Chem. 276: 41086 -41094 desvela un anticuerpo anti-PPLR.

Un anticuerpo monoclonal para PRLR disminuyó la incidencia de tumores mamarios en ratones (Sissom y col., Am.

J. Pathol. 133:589-595, 1988) . Además, un antagonista de PRL (PRL mutante S179D) inhibió la proliferación de una línea celular de carcinoma de próstata humano, DU-145, in vitro y DU-145 indujo tumores in vivo (Xu y col., Cancer Res., 61:6098-6104, 2001) .

Así, hay una necesidad de identificar composiciones y procedimientos que modulen PRLR y su función en tales cánceres. La presente invención se refiere a estas, además de a otras, necesidades importantes.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La secuencia de nucleótidos para PRLR se expone en SEC ID Nº: 1, y la secuencia de aminoácidos se expone en SEC ID Nº: 2. El dominio extracelular (DEC) consiste en los aminoácidos 25 a 234 de SEC ID Nº: 2, que puede dividirse en dos dominios principales, S1 (aminoácidos 25-122) y S2 (aminoácidos 123-234) . Se han identificado varias isoformas diferentes de PRLR: larga (L) , intermedia (I) , ΔS1, una forma soluble inactiva (PRLBP) y formas cortas inactivas S1a y S1b. Los exones y regiones de nucleótidos contenidos dentro de cada isoforma se muestran en la Figura 1. En realizaciones a modo de ejemplo, la invención contempla anticuerpos que se unen al dominio S1 y/o al dominio S2. Tales anticuerpos que se unen al dominio S2 pueden elegir como diana todas las isoformas activas. La invención también contempla anticuerpos que se unen específicamente a una isoforma y no a otra (por ejemplo, intermedia y no S1a o S1b) , o a las isoformas activas (larga, intermedia y ΔS1) , pero no a las isoformas inactivas (S1a y... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo que tiene una constante de disociación en equilibrio de 10-6 M o inferior con respecto a PRLR y que comprende 6 CDR, en el que:

(a) (i) CDRL1 tiene la secuencia RASKSVSTSGYTYMH;

(ii) CDRL2 tiene la secuencia LASNLES;

(iii) CDRL3 tiene la secuencia QHSGELPPS;

(iv) CDRH1 tiene la secuencia SYGMS;

(v) CDRH2 tiene la secuencia ATVSSGGTYTYYPDSVKG; y

(vi) CDRH3 tiene la secuencia HRGNYYATYYYAMDY; o

(b) (i) CDRL1 tiene la secuencia KASKSVSTSGYTYMH;

(ii) CDRL2 tiene la secuencia LASNRES;

(iii) CDRL3 tiene la secuencia QHSGELPPS;

(iv) CDRH1 tiene la secuencia SYGMS;

(v) CDRH2 tiene la secuencia TVSSGGTYTYYPDSVKG; y

(vi) CDRH3 tiene la secuencia HRGNYYATYYYAMDY.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo manipulado humano, un anticuerpo humano, un anticuerpo monocatenario o un fragmento de anticuerpo.

3. El anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: i) una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 86 y 88; ii) una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 87, 89 y 90; iii) una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable SEC ID Nº: 88 y una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable de SEC ID Nº: 89; iv) una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable SEC ID Nº: 88 y una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable de SEC ID Nº: 90 y v) una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable SEC ID Nº: 86 y una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable de SEC ID Nº: 87.

4. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la región constante de la cadena pesada es una IgG, IgM, IgA, IgD, IgE modificada o sin modificar, un fragmento de las mismas, o combinaciones de las mismas.

5. El anticuerpo de la reivindicación 4, en el que la región constante de la cadena pesada es una IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 modificada o sin modificar.

6. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que tiene una constante de disociación en equilibrio de 10-7, 10-8 ó 10-9 M o inferior con respecto a PRLR.

7. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la región constante de la cadena ligera es una región constante de la cadena ligera lambda modificada o sin modificar, una región constante de la cadena ligera kappa, un fragmento de las mismas, o combinaciones de las mismas.

8. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que inhibe una actividad seleccionada del grupo que consiste en i) dimerización de PRLR; ii) fosforilación intracelular de PRLR; iii) inducción de la fosforilación de MAPK; iv) inducción de la fosforilación de Sta 5; v) inducción de la fosforilación de AKT; vi) unión de PRL a PRLR; vii) producción y/o angiogénesis de VEGF; y viii) proliferación de un cáncer de células de mama, próstata o pulmón.

9. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que está conjugado con otro agente de diagnóstico o terapéutico.

10. Un procedimiento de selección de un anticuerpo para el dominio extracelular de una proteína de PRLR útil para el tratamiento de cáncer que comprende las etapas de:

poner en contacto un polipéptido que comprende el DEC de PRLR con un anticuerpo candidato que contiene las 6 CDR del anticuerpo de la reivindicación 1; detectar la afinidad de unión del anticuerpo candidato por el polipéptido, e identificar dicho anticuerpo candidato como un anticuerpo útil para el tratamiento de cáncer si se detecta una constante de disociación en equilibrio de 10-6 M o inferior.

11. Un procedimiento de alteración sistemática de anticuerpos y de selección de un anticuerpo para el dominio extracelular de una proteína de PRLR útil para el tratamiento de cáncer que comprende las etapas de:

preparar un anticuerpo candidato que contiene modificaciones a uno o dos aminoácidos dentro de las CDR del anticuerpo de la reivindicación 1, poner en contacto un polipéptido que comprende el DEC de PRLR con dicho anticuerpo candidato, detectar la afinidad de unión del anticuerpo candidato por el polipéptido, e identificar dicho anticuerpo candidato como un anticuerpo útil para el tratamiento de cáncer si se detecta una constante de disociación en equilibrio de 10-6 M o inferior.

12. Un procedimiento de selección de un anticuerpo para el dominio extracelular de una proteína de PRLR útil para el tratamiento de cáncer que comprende las etapas de:

poner en contacto una célula de mama, pulmón o próstata con un anticuerpo candidato que contiene las 6 CDR del anticuerpo de la reivindicación 1 o un anticuerpo que contiene una modificación de uno o dos aminoácidos dentro de una o más CDR; detectar proliferación o supervivencia de dicha célula; e identificar dicho anticuerpo candidato como un anticuerpo útil para el tratamiento de cáncer si se detecta una disminución en la proliferación o supervivencia celular.

13. Un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en un procedimiento para tratar un sujeto que padece cáncer.

14. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para su uso en un procedimiento para tratar según la reivindicación 13, en el que el cáncer es cáncer de mama, pulmón o de próstata.

15. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para su uso en un procedimiento para tratar según la reivindicación 14, en el que se administra un segundo agente terapéutico.

16. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para su uso en un procedimiento para tratar según la reivindicación 15, en el que el anticuerpo comprende:

(a) una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable de SEC ID Nº: 86 y una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable de SEC ID Nº: 87;

(b) una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable de SEC ID Nº: 88 y una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable de SEC ID Nº: 89; o

(c) una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable de SEC ID Nº: 88 y una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable de SEC ID Nº: 90.

17. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para su uso en un procedimiento para tratar según la reivindicación 14, en el que el sujeto es positivo para expresión de PRLR y: i) expresión de HER2-neu, y en el que dicho segundo agente terapéutico es un anticuerpo anti-Her2-neu; o ii) expresión de ER, y en el que dicho segundo agente terapéutico es un anticuerpo anti-ER.

18. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para su uso en un procedimiento para tratar según la reivindicación 14, en el que el sujeto se trata adicionalmente con radioterapia o cirugía.

19. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para su uso en un procedimiento de elección como diana de una célula tumoral que expresa PRLR, en el que dicho anticuerpo está conjugado con un radionúclido u otra toxina.

20. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para su uso en un procedimiento para tratar según las reivindicaciones 14-18, o el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para su uso en un procedimiento de elección como diana de una célula tumoral que expresa PRLR según la reivindicación 19, en el que el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un ser humano.

21. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada o cadena ligera de un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

22. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 21 operativamente ligada a una secuencia de control reguladora.

23. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 22 o una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 21.

24. Un procedimiento de uso de la célula huésped de la reivindicación 23 para producir un anticuerpo, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 23 bajo condiciones adecuadas y recuperar dicho anticuerpo.

25. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 que se purifica a al menos el 95 % de homogeneidad en peso.

26. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la reivindicación 25 y un vehículo 5 farmacéuticamente aceptable.

27. Un kit que comprende un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo, envasada en un recipiente, conteniendo dicho kit opcionalmente un segundo agente terapéutico, y que comprende además una etiqueta unida a o envasada con el recipiente, describiendo la etiqueta el contenido del recipiente y proporcionando indicaciones y/o instrucciones referentes al uso del contenido del recipiente para tratar cáncer, por ejemplo, en el que el recipiente es un vial o botella o jeringuilla precargada.