Actividad anti-amiloide de la inmunoblogulina intravenosa (IVIG) in vitro.

Un método para preseleccionar los lotes de inmunoglobulina intravenosa (IVIG) más adecuados paraadministrar a los pacientes que padecen enfermedad de Alzheimer (EA),

comprendiendo el método:

a) poner en contacto cultivos celulares de ensayo con agregados de Aß citotóxicos y con lotes de IVIG.

b) determinar el nivel de citotoxicidad en los cultivos celulares de ensayo y

c) comparar el nivel de citotoxicidad en los cultivos de ensayo con el nivel de citotoxicidad en un cultivo celularcontrol, identificando y seleccionando de este modo el lote de IVIG que es el más adecuado para su administración apacientes que padecen EA.

ACTIVIDAD ANTI-AMILOIDE DE LA INMUNOBLOGULINA INTRAVENOSA (IVIG) IN VITRO

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método para preseleccionar los lotes de inmunoglobulina intravenosa más adecuados para su administración a pacientes que padecen la enfermedad de Alzheimer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La acumulación de Aβ citotóxico en el cerebro se considera un acontecimiento patogénico clave que contribuye a la neurodegeneración en la enfermedad de Alzheimer (EA) . Véase, Hardy y Selkoe, (2002) , Science 297:353-336.

Aβ es un metabolito producido durante el procesamiento de una glucoproteína transmembrana grande, la proteína precursora de Aβ (APP) . El nivel de Aβ en el cerebro está controlado por la tasa de producción a partir de la proteína 15 precursora de amiloide (APP) y la tasa de aclaramiento. Véase, Tanzi y col., (2004) Neuron 43:605-608. Aβ se forma tras la escisión secuencial de APP, que es una glucoproteína transmembrana de función no determinada. APP puede procesarse mediante enzimas secretasas α, β y γ, y la proteína Aβ se genera por acción sucesiva de las secretasas β y γ sobre APP. El extremo C-terminal del péptido Aβ se produce por la acción de la secretasa γ, que corta dentro de la región transmembrana de APP para generar diversas isoformas de una longitud de 39-43 restos de aminoácidos. Las isoformas más frecuentes son Aβ40 y Aβ42. La forma más corta (Aβ40) se produce normalmente mediante una reacción de escisión que se produce en el retículo endoplásmico, mientras que la forma más larga (Aβ42) se produce típicamente mediante una reacción de escisión en la red trans Golgi. Véase, Nat. Med. 3 (9) :10161020 (1997) . La forma Aβ40 es la más frecuente de las dos, aunque la Aβ42 es más fibrilogénica y, por tanto, se asocia más frecuentemente con estados patológicos. Se ha observado que mutaciones en APP asociadas con el

Alzheimer de aparición temprana aumentan la producción relativa de Aβ42 y, por tanto, esto sugiere una vía de tratamiento del Alzheimer que suponga la modulación de la actividad de las secretasas β y γ para producir principalmente Aβ40. (Véase, Yin, Y. I., y col. (2007) J Biol. Chem., 10 de agosto; 282 (32) :23639-44.

Recientemente se ha demostrado que la vacunación con Aβ42, así como la inmunización pasiva con anticuerpos anti-Aβ42. reduce la carga de Aβ en el cerebro y mejora el comportamiento en modelos animales. Véase, por ejemplo, Schenk y col. (1999) Nature 400:173-177; DeMattos y col., (2001) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 98:88508855; Bard y col. (2000) Nat. Med. 6:916-919; Wilcock y col. (2003) J. Neurosci. 23:3745-3751. Aunque se ha publicado una reducción en el depósito de Aβ (Nicoll y col. (2006) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 65:1040-1048) y un deterioro más lento de la función cognitiva (Hock y col., (2003) Neuron 38:547-554) en ensayos clínicos de inmunización con anticuerpos anti-Aβ42 en pacientes con EA, los ensayos clínicos también mostraron efectos neuroinflamatorios adversos como resultado de la inmunización.

En humanos, se han detectados anticuerpos naturales frente a Aβ tanto en líquido cefalorraquideo (LCR) como en el suero de individuos sanos, mientras que se han detectado valores significativamente menores de anticuerpos antiAβ en el LCR de pacientes con EA. Véase, Du y col. (2001) Neurology 57:801-805.

Se detectan anticuerpos naturales anti-Aβ42 en preparaciones comerciales de inmunoglobulina intravenosa (IVIG) humana y se ha encontrado que modifican las concentraciones totales de Aβ y Aβ42 en el LCR. Véase, Dodel y col. (2002) Ann. Neurol. 52:253-256 y Dodel y col. (2004) J. Neurosurg. Psychiatr y 75:1472-1474. Además, se ha 45 demostrado previamente que los anticuerpos naturales anti-Aβ, cuando se aíslan a partir de preparaciones de inmunoglobulinas, inhiben la actividad citotóxica inducida por Aβ in vitro (Du y col. (2003) Brain 126:1935-1939) . B. Solomon describe el uso de IVIG en inmunoterapia para la enfermedad de Alzheimer (Solomon (2007) Curr. Opin. Mol. Ther. 9:79-85) . Reipert y col. describen la variabilidad entre lotes de IVIG en la proporción de actividades de estimulación e inhibición anti-Fas y sugieren la preselección de lotes adecuados para diferentes objetivos terapéuticos (Reipert y col. (2008) Vox Sanguinis 94:334-341) .

Por tanto, existe la necesidad de un método para analizar y comparar la capacidad de diversos agentes (p. ej., diferentes lotes de preparaciones de inmunoglobulinas) para inhibir la citotoxicidad inducida por Aβ in vitro. Este método permitirá la identificación de posibles fármacos candidatos así como la preselección de lotes de (IVIG)

plasmática humana para el tratamiento de pacientes con enfermedad de Alzheimer. En la presente invención se aborda esta y otras necesidades.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona un método para preseleccionar los lotes de IVIG más adecuados para administrar a pacientes que padecen EA, comprendiendo el método :

a) poner en contacto los cultivos celulares de ensayo con agregados de Aβ citotóxicos y con los lotes de IVIG,

b) determinar el nivel de citotoxicidad en los cultivos celulares de ensayo y c) comparar el nivel de citotoxicidad en los cultivos de ensayo con el nivel de citotoxicidad en un cultivo celular control, identificando y seleccionando de este modo el lote de IVIG que es más adecuado para administrar a los pacientes que padecen EA.

El nivel de citotoxicidad en el cultivo celular de ensayo se normaliza hasta el nivel de citotoxicidad del cultivo celular

control y puede seleccionarse de este modo un lote de IVIG adecuado que inhibe la citotoxicidad inducida por Aβ. En algunas realizaciones, el cultivo celular control es idéntico al cultivo celular de ensayo excepto por la presencia del lote de IVIG. En algunas realizaciones, el cultivo celular control comprende los agregados de Aβ citotóxicos. En algunas realizaciones, el cultivo celular control comprende los agregados de Aβ citotóxicos y un agente control que se sabe inhibe la citotoxicidad inducida por Aβ.

En algunas realizaciones, el péptido Aβ tiene una longitud de 43 aminoácidos. En algunas realizaciones, el péptido Aβ tiene una longitud de entre 39 y 43 aminoácidos. En algunas realizaciones, el péptido Aβ tiene una longitud menor de 39 aminoácidos. En algunas realizaciones, el agregado de Aβ comprende al menos un dímero Aβ. En algunas realizaciones, los agregados de Aβ citotóxicos se caracterizan usando un ensayo cuantitativo de fluorescencia de unión a tioflavina T.

En algunas realizaciones, los agregados de Aβ se usan en un intervalo de concentración de aproximadamente 2, 5 μM a aproximadamente 25 μM. En algunas realizaciones, el intervalo de concentración de los agregados de Aβ es de aproximadamente 5 μM a aproximadamente −30 μM. En algunas realizaciones, el intervalo de concentración de los agregados de Aβ es de aproximadamente 10 μM a aproximadamente 15 μM.

En algunas realizaciones de la invención, la célula susceptible es una célula PC-12. En algunas realizaciones, una célula susceptible se identifica demostrando que la célula muestra una respuesta citotóxica detectable en presencia de una solución de agregado de Aβ citotóxico en el intervalo de aproximadamente 2, 5 μM a aproximadamente 25

μM. En algunas realizaciones, las células se adaptan al crecimiento en condiciones sin suero. En algunas realizaciones, las células se crecen en presencia de suero o un suplemento sérico y, a continuación, se cambian a condiciones sin suero antes de realizar el ensayo.

En algunas realizaciones, el control se selecciona entre el grupo constituido por una proteína, un anticuerpo, un péptido, un complejo proteináceo, un lípido, un hidrato de carbono, un lote de IVIG y una molécula pequeña. En algunas realizaciones, el agente de control es un anticuerpo que se une a Aβ.

En algunas realizaciones, los lotes de IVIG y/o el agente control se ponen en contacto con el cultivo celular antes que los agregados de Aβ citotóxicos. En algunas realizaciones, los agregados de Aβ citotóxicos se ponen en contacto con los cultivos de ensayo y/o control antes que los lotes de IVIG y/o los agentes control. En algunas realizaciones, los lotes de IVIG y/o el agente control se mezclan previamente con los agregados de Aβ citotóxicos antes de ponerlos en contacto con los respectivos cultivos celulares.

1. Un método para preseleccionar los lotes de inmunoglobulina intravenosa (IVIG) más adecuados para administrar a los pacientes que padecen enfermedad de Alzheimer (EA) , comprendiendo el método:

a) poner en contacto cultivos celulares de ensayo con agregados de Aβ citotóxicos y con lotes de IVIG.

b) determinar el nivel de citotoxicidad en los cultivos celulares de ensayo y

c) comparar el nivel de citotoxicidad en los cultivos de ensayo con el nivel de citotoxicidad en un cultivo celular control, identificando y seleccionando de este modo el lote de IVIG que es el más adecuado para su administración a pacientes que padecen EA.

2. El método de la reivindicación 1, que además comprende los pasos de:

poner en contacto el cultivo celular control con el agregado de Aβ citotóxico y

determinar el nivel de citotoxicidad en el cultivo celular control.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el cultivo celular control se pone en contacto con el agregado de Aβ citotóxico y con un agente control, en el que es sabido que el agente control inhibe la citotoxicidad inducida por Aβ.

4. El método de la reivindicación 1, en el que los lotes de IVIG se ponen en contacto con los cultivos 25 celulares de ensayo antes que los agregados de Aβ citotóxicos.

5. El método de la reivindicación 1, en el que los agregados de Aβ citotóxicos se ponen en contacto con los cultivos celulares de ensayo antes que los lotes de IVIG.

6. El método de la reivindicación 1, en el que los lotes de IVIG y los agregados de Aβ citotóxicos se mezclan previamente antes de ponerlos en contacto con los cultivos celulares de ensayo.

7. El método de la reivindicación 1, en el que los cultivos celulares de ensayo y el cultivo celular control

se crecen en condiciones sin suero. 35

8. El método de la reivindicación 1, en el que el cultivo celular de ensayo y el cultivo celular control contienen células PC-12.

9. El método de la reivindicación 3, en el que el agente control es un anticuerpo anti-Aβ. 40

10. El método de la reivindicación 1, en el que el agregado de Aβ está compuesto por Aβ1-40 o Aβ1-42.

11. El método de la reivindicación 1, en el que el agregado de Aβ citotóxico está compuesto por al menos

un dímero de Aβ. 45

12. El método de la reivindicación 11, en el que el contenido fibrilar del agregado de Aβ citotóxico se cuantifica usando un ensayo de fluorescencia de tioflavina T.

13. El método de la reivindicación 1, en el que los agregados de Aβ citotóxicos se presentan en un 50 intervalo de concentración de aproximadamente 2, 5 μM a aproximadamente 25 μM.

14. El método de la reivindicación 1, en el que los agregados de Aβ citotóxicos se presentan en un intervalo de concentración de aproximadamente 5 μM a aproximadamente -30 μM.

15. El método de la reivindicación 1, en el que los agregados de Aβ citotóxicos se presentan en un intervalo de concentración de aproximadamente 10 μM a aproximadamente 15 μM.

16. El método de la reivindicación 3, en el que los lotes de IVIG y el agente control se presentan en concentraciones equimolares. 60

17. El método de la reivindicación 3, en el que los lotes de IVIG y el agente control se presentan en un intervalo de relaciones de concentración molar con el agregado de Aβ citotóxico (agente:Aβ) de aproximadamente 30:1 a aproximadamente 1:30.

18. El método de la reivindicación 1, en el que el nivel de citotoxicidad se determina midiendo la concentración de lactato deshidrogenasa en los medios de cultivo.

19. El método de la reivindicación 1, en el que el nivel de citotoxicidad se determina midiendo el nivel de apoptosis en los cultivos celulares.