Activación de la ECA2 para el tratamiento de enfermedades cardíacas, pulmonares, renales e hipertensión.

Uso de un polipéptido de la ECA2 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de lesión pulmonaraguda.

Activación de la ECA2 para el tratamiento de enfermedades cardíacas, pulmonares, renales e hipertensión Campo de la invención La presente invención y divulgación proporciona composiciones y procedimientos para uso en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades cardíacas, pulmonares y renales, incluyendo hipertensión, enfermedad cardíaca coronaria, insuficiencia cardíaca y renal, edema pulmonar y lesión pulmonar, tal como en choque tóxico o ventilación artificial.

Antecedentes de la invención La enfermedad cardiovascular será la número uno de la carga sanitaria del siglo XX1 y se ha predicho que será la causa más frecuente de muerte en el mundo en 2020. Un factor de riesgo principal para la enfermedad cardíaca es la hipertensión.

La hipertensión es un rasgo cuantitativo multifactorial controlado tanto por factores genéticos como ambientales. Aunque se conoce mucho acerca de los factores ambientales que pueden contribuir a la presión arterial alta, tales como la dieta y la actividad física, se conoce menos sobre los factores genéticos que son responsables de la predisposición a enfermedades cardiovasculares. A pesar de la identificación de varios supuestos loci genéticos de rasgo cuantitativo (QTL) asociados a la hipertensión en modelos animales, ninguno de estos loci se ha traducido en genes. De este modo, los mecanismos moleculares y genéticos que subyacen a la hipertensión y a otras enfermedades cardiovasculares permanecen en gran medida oscuros.

Un regulador crítico de la homeostasis de la presión arterial es el sistema renina -angiotensina (RAS) . La proteasa renina escinde el angiotensinógeno en el péptido decamérico inactivo angiotensina I (AngI) . La acción de la enzima convertidora de la angiotensina (ECA) cataliza después la escisión de la Angl en el octómero activo angiotensina II (AngII) , que puede contribuir a la hipertensión estimulando la vasoconstricción del músculo liso vascular y la reabsorción de sodio en el túbulo renal. Los ratones mutantes para la ECA muestran hipotensión espontánea, infertilidad masculina parcial y malformaciones renales. En seres humanos, un polimorfismo de la ECA se ha asociado a determinantes de las funciones renal y cardiovascular, y la inhibición farmacológica de la ECA y los receptores de AngII son eficaces en la reducción de la presión arterial y enfermedad renal. Además, la inhibición de la ECA y los receptores de Angll tienen efectos beneficiosos en la insuficiencia cardíaca.

Recientemente se ha identificado un homólogo de la ECA, denominado ECA2, que se expresa predominantemente en las células endoteliales vasculares del riñón y del corazón. De manera interesante, también existen dos homólogos de la ECA en las moscas. Al contrario que la ECA, la ECA2 funciona como carboxipeptidasa, que escinde un único resto de AngI y genera Ang1-9, y un único resto de AngII para generar Ang1-7. Estos datos bioquímicos in Vitro han sugerido que la ECA2 modula el RAS y, de este modo, desempeña un papel en la regulación de la presión arterial. Se conoce el papel in vivo de la ECA2 en el sistema cardiovascular y el RAS.

Acton y col., en la patente de Estados Unidos Nº 6.194.556 describen el uso de la ECA2 en la diagnosis y terapéutica de los estados asociados a la ECA2. La patente estableció que los niveles de expresión de la ECA2 se incrementan con la hipertensión y que los antagonistas o los inhibidores de la ECA2 serían útiles en el tratamiento de un incremento de la presión arterial o de trastornos relacionados. La solicitud de patente canadiense nº 2.372.387 proporciona ejemplos específicos de inhibidores de la ECA2 que, se pretende que sean útiles para el tratamiento de enfermedad cardíaca enfermedad cardíaca, tal como hipertensión. Esto de nuevo enfatiza la necesidad de inhibir, en lugar de incrementar, la actividad de la ECA2. Estas referencias, que enseñan la necesidad de inhibir la actividad de la ECA2, se basan solamente en los datos experimentales in vitro. No proporcionan datos in vivo, tales como los datos de mamíferos inactivados, para caracterizar ECA2. Hasta la fecha, no se ha aprobado ningún inhibidor de la ECA2 como compuesto farmacéutico para el tratamiento de hipertensión. Además, el papel in vivo de la ECA2 en el sistema cardiovascular y el RAS permanece en gran medida desconocido. Permanece una necesidad de caracterizar la función de la ECA2 con el fin de sea capaz de diseñar ensayos de diagnóstico apropiados y compuestos farmacéuticos para el tratamiento de enfermedad cardíaca y renal.

Sumario de la invención La divulgación proporciona un nuevo paradigma para la regulación del sistema renina -angiotensina y muestra un uso completamente nuevo e inesperado de la ECA2, en contraste con la predicción basada en los datos in vitro (patente de Acton) y no esperada en la técnica anterior, como un regulador crítico negativo del RAS requerido para la función cardiaca y el control de la presión arterial. La activación de la ECA2 es crítica para el tratamiento y la prevención de enfermedad cardíaca, pulmonar y renal. La divulgación muestra por la primera vez que la administración de un activador de la ECA2 a un animal previene y trata la hipertensión y la enfermedad cardíaca y renal y la lesión pulmonar.

Breve descripción de las figuras

Las realizaciones preferidas de la invención se describirán en relación con las figuras, en las que: Figura 1. Secuencia y mapeo cromosómico de la ECA2 de rata.

a, alineación proteica de la ECA2 de rata, de ratón y ser humano, con ECA de testículos humanos y de ratón (T-ACE) . El sombreado en negro indica la identidad de aminoácidos y el sombreado en gris indica el grado de similitud de aminoácidos. b, Estructura esquemática del dominio de la ECA y la ECA2. Se debe hacer notar que la ECA2 solamente contiene el dominio de la ECA con el sitio de unión de cinc de consenso HEMGH. Los centros catalíticos se indican en negro, el péptido señal se indica en gris y el dominio transmembrana en líneas discontinuas. c, Patrones de expresión de los genes de la ECA2 de rata y ratón en diferentes tejidos adultos y en días diferentes del desarrollo embrionario (E7 = día embrionario 7) . Se debe hacer notar que están presentes dos isoformas para la ECA2 en ratones, pero no en rata o en ser humano (no mostrado) , una característica similar a la observada para la ECA15. d, Resultados del mapeo de híbrido de radiación de la ECA2 de rata, comparado con el mapeo de QTL identificado en animales sensibles a sal Sabra (SS-, SHRSP (BP3) , y SHR (BB.Xs) . Los nombres de los marcadores polimórficos se indican a la izquierda del ideograma. Se muestran las puntuaciones LOD y los valores theta para los marcadores unidos a la ECA2. cR = centiRadianes.

Figura 2. Niveles de expresión de la ECA2 en modelos de ratas de hipertensión.

a, análisis de transferencia Northern de ARNm de la ECA2 de riñones de ratas Sabra SBH/y y SBN/y. La sección anterior muestra la representación de transferencias de Northern con niveles de control de actina. El panel inferior muestra los niveles relativos de mensaje de la eca2 normalizado para los niveles de actina. b, Análisis de transferencia de Western de los nivel proteína de la ECA2 de riñones de Sabra SBH/y y sus ratas control SBN/y, así como SHR y SHRSP y sus ratas control WKY. La sección superior muestra transferencias de Western representativas. Se indica la presión arterial sistólica (BP) en mmHg para las respectivas ratas Sabra. El panel inferior muestra los niveles de proteína relativos de la ECA2 corregidos para actina. Las barras muestran los valores medios +/-ETM. * = p < 0, 05, ** = p < 0, 01. (n = 4, para todos los grupos) .

Figura 3. Rotura dirigida de la ECA2 de ratón mediante recombinación homóloga.

a, Estrategia de dirección de genes. Se muestra una parte del locus de tipo salvaje de la eca2 murino (parte superior) . Los recuadros en negro indican exones. El vector de dirección se diseñó para reemplazar el exón 9 que codifica el dominio catalítico de unión a cinc con el módulo del gen de resistencia a neomicina (neo) colocado en la orientación de sentido contrario. Se usó la timidita quinasa (TK) para la selección negativa. Las sondas flanqueantes de 3’ y 5’ usadas para los análisis de Southern se indican con un recuadro de línea discontinuo. b, análisis de transferencia Southern de células eca+/y y eca-/y ES. Se digirió el ADN genómico con EcoRI y se hibridó con la sonda flanqueante de 3’ y 5’ mostrada en (a) . c, Análisis de transferencia de Western de la proteína de expresión de la ECA2 en los riñones de ratones eca2 eca´. El anti-ECA2 Ab es reactivo con una región N-terminal a la supresión. d, análisis de RT-PCR... [Seguir leyendo]

1. Uso de un polipéptido de la ECA2 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de lesión pulmonar aguda.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polipéptido ECA2 es un polipéptido ECA2 humano.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el polipéptido ECA2 comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2 o un fragmento del mismo, en el que el fragmento consiste en al menos 5 aminoácidos y conserva actividad.

4. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el polipéptido ECA2 comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos un 80% con la SEC ID Nº 2 y los cambios de aminoácidos están en una porción del polipéptido no implicado en proporcionar actividad o están en una porción del polipéptido implicada en proporcionar actividad, de modo que la mutación aumenta o disminuye la actividad del polipéptido.

5. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido ECA2 que comprende la SEC ID Nº 2, o un fragmento del mismo, combinado con un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que la composición es adecuada para inyección intravenosa y en la que el fragmento consiste en al menos 5 aminoácidos y conserva actividad, para el tratamiento de ALI.

6. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5 para el tratamiento del SDRA (Síndrome de dificultad respiratoria del adulto) .

Figura 1